当流式细胞术遇上RNA

流式细胞术与RNA之间其实有着一段不为人知的恋爱史，来复习、见证一下他们之间的相遇、相知和相爱。

流式细胞术检测DNA和各类蛋白质（抗体）的应用研究随着流式技术的问世即开始研究。尽管RNA是连接DNA和蛋白质的纽带，但在流式与DNA、蛋白质热恋时，RNA却被冷落一旁，可能是因为RNA容易降解，也可能研究者们没有为它们俩牵线搭桥。直到八九十年代，研究者才开始利用吖啶橙（Acridine Orange）检测RNA总量，以此来评估细胞总体代谢活性和鉴定不同肿瘤。

随着流式技术的发展以及研究者对RNA研究的需求深入，流式开始与一些特定的mRNA检测“牵手”了，它们俩“牵手”的方式主要有两种：

相见后，流式与RNA家族的交集越来越大。除了总RNA和mRNA，两者还逐步向rRNA进发（http://nar.oxfordjournals.org/content/20/1/83.abstract）。
除了检测高丰度的RNA，还慢慢尝试着检测低丰度的RNA（http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0057002）。RNA认识到了流式细胞术对于它的重要性，而流式也在发掘RNA在各类细胞、疾病中的作用中渐渐担负起该有的责任，因为流式觉得，PCR像是城管，硬是将“房子”拆了，将RNA赶到一个熔炉中检测，这是很不人道的，应该让RNA安安静静地待在“房子”中。流式只想静静地递几束花进去，然后用一束光扫描它，不想破坏那完整的温馨环境。

此时，RNA和流式都觉得开始了解对方了。

流式技术进一步发展，为他和RNA之间的感情升温提供了良好的条件。新的检测技术可以更敏感而特异地检测出低丰度RNA，将流式与RNA的恋爱史推到一个新的高度。其中的技术代表就是Affymetrix eBioscience的QuantiGeneⓇ FlowRNA这一新型的原位杂交技术，可实现单细胞水平最多三个RNA转录本同时检测。检测原理就是利用寡聚核苷酸探针与Branched DNA信号放大技术，实现单个细胞内低丰度RNA检测（如图1）：

图1:QuantiGene FlowRNA Assay工作流程

PCR可以检测通过逆转录检测RNA，那么流式检测RNA的优势体现在哪里？

如图2所示，使用标记有FITC的CD14抗体对人外周血单核细 胞(PBMC)的表面标志物进行染色。按照操作说明对标记 CD14抗体的细胞进一步做CD14 RNA杂交并放大信号,以 同时检测CD14 RNA的表达。流式细胞仪收集数据后,利用 前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)参数设门,以分离单核 细胞和淋巴细胞群(图2A),可得结果单核细胞群其CD14 RNA和蛋白质的表达表现出双阳性(图2B),而淋巴细胞不 表达CD14 RNA或蛋白质(未显示)。

或者也可使用抗体/荧光染料标记的二抗系统,利用未标记 的抗体捕获人PBMC 表面的β2微球蛋白(B2M),该蛋白为 管家基因,所有血细胞中均有呈现。按照操作说明使用探针 组杂交表面抗体标记后的细胞B2M RNA,之后利用PE二抗 进行染色。采用与上文相似的设门策略,数据分析表明B2M 蛋白质和RNA在淋巴细胞以及单核细胞中均有表达(图2C、 2D)。综上,图中呈现的数据表明特定目标细胞中的CD14 RNA信号与CD14蛋白质表达的相关性良好。此外,利用 QuantiGene FlowRNA-RNA ISH分析的条件下,也能同时 实现细胞表面标志物的检测。 

图2:利用结合有荧光染料的单核细胞特异的表面标志 CD14 FITC对人PBMC进行染色。抗体标记的PBMC经QuantiGene FlowRNA 试剂标记,将CD14 RNA探针组与标记抗体后的细胞杂交。设定门界如图2A所示。图2B中显示了单核细胞群的CD14 蛋白质和RNA表达水平。PBMC经过B2M抗体/PE结合二抗系统的染色后,用B2M RNA探针组杂交靶标RNA。淋巴细胞和单核细 胞群都表现出B2M蛋白质和RNA表达双阳性(图2C和2D)。

看了上面的例子，可能会有人觉得这项技术的特异性会不会不行？有意思的是，QuantiGene FlowRNA设计寡聚核苷酸探针时考虑到了这点，他们要求只有在两个相邻的目标寡聚核苷酸探针(左侧寡聚核苷 酸探针和右侧寡聚核苷酸探针)与特异靶标同时结合时才能 实现信号放大（见图3）。 

再来看一个例子，在炎症反应中,脂多糖(LPS)等的刺激后血细胞被激活产 生促炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNFα)。通常使用流式 抗体结合流式仪来检测这些细胞因子。为了研究特定亚群细 胞的相关因子RNA转录本的表达,用LPS和R848处理PBMC 4小时,然后用FITC-CD14的抗体对细胞进行染色,再用QuantiGene FlowRNA试剂标记,根据FSC/SSC 设门分离出 单核细胞亚群(图4A)。在CD14阳性的单核细胞中,细胞 因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα)RNA的表达在刺激4小 时后明显上调(图4B)。 

故事讲到这里，很显然，流式和RNA的恋爱故事会继续下去，这段新恋情肯定会越来越热闹。Affymetrix eBioscience的Quantigene FlowRNA还是很有意思的一项技术，可以给流式的应用带来不小扩展空间（http://www.ebioscience.com/application/flowrna.htm）

1. http://7pn5d7.com1.z0.glb.clouddn.com/Affymetrix2015/QuantiGene_FlowRNA_Assay_Application_Note%20CN%202015.03.pdf

2. Grunwald D. Flow cytometry and RNA studies. Biol Cell. 1993;78(1-2):27-30.