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标题: 荧光扣除对照(FMO)概念和示例 [打印本页]

作者: niwanmao    时间: 2013-4-1 14:42
标题: 荧光扣除对照(FMO)概念和示例
在流式检测中,设门最好是按照荧光扣除对照来设。那么什么叫荧光扣除对照呢(Fluorescence Minus One,FMO)?FMO对照就是你设计的方案中除了你要检测的目的抗体之外,其它抗体都加上,这种对照可以帮助你衡量其它通道究竟有多少荧光漏到目的通道,从而使你能够更精确地设置阳性/阴性群体界限。
FMO对照在下列情形下尤为重要:1、定量极弱或分群不清的细胞群体。2、在试剂优化时衡量荧光溢漏。
使用FMO对照需要注意:1、荧光完全不重叠的通道之间,不需要。2、无法衡量背景荧光,如果抗体相关的背景非常明显,则不适合再用FMO来设定分界。
下面这个例子提示我们,空白对照不能代替FMO设门:
[attach]2838[/attach]


作者: samly0    时间: 2013-4-1 15:34
请问在这个FMO中检测到的漏进去的荧光怎么扣除?是通过设门去除还是调补偿去除?这个FMO的作用与我分不同通道的单标抗体调补偿扣除有什么区别?
作者: niwanmao    时间: 2013-4-1 15:41
samly0 发表于 2013-4-1 15:34
请问在这个FMO中检测到的漏进去的荧光怎么扣除?是通过设门去除还是调补偿去除?这个FMO的作用与我分不同通 ...

单标主要目的是用于调节补偿。
FMO对照的目的是为了在补偿调节完成之后,分析时能够精确设门而做的。
作者: samly0    时间: 2013-4-1 16:10
哦,有点糊涂了,但调节补偿的目的不是去除其他通道漏到被检通道的荧光么?调好补偿后,怎么FMO还能检测得到漏到的荧光?
作者: niwanmao    时间: 2013-4-1 19:06
samly0 发表于 2013-04-01 16:10:23
哦,有点糊涂了,但调节补偿的目的不是去除其他通道漏到被检通道的荧光么?调好补偿后,怎么FMO还能检测得

调节补偿的目的是为了去除漏进来的荧光,但是我后续如何设门,设在哪里才合适呢?就需要根据fmo对照,如果你只有两种颜色,这时单标的就是fmo,但如果更多,就还需要考虑其它颜色对该通道的影响。
作者: gcz5340    时间: 2013-4-1 22:09
我觉得:荧光补偿后背景荧光会增强是为什么要设置FMO对照的原因,如图中,CD8阳性群体调完补偿后是一个弥散状态,这就会导致CD4背景荧光的增强,所以就应该以FMO对照作为gating control。
补偿虽然能消除荧光之间的光谱重叠,但也会引起背景荧光的增加,颜色越多影响越大,这也是多色实验无法绕开的难题。
作者: samly0    时间: 2013-4-1 22:13
这个我明白了,只是还是有点不理解在已经调好补偿后做的fmo图里面,阴性细胞群以外多出的那部分荧光信号是怎么来的?可能有点钻牛角了,呵呵
作者: niwanmao    时间: 2013-4-1 22:42
samly0 发表于 2013-04-01 22:13:55
这个我明白了,只是还是有点不理解在已经调好补偿后做的fmo图里面,阴性细胞群以外多出的那部分荧光信号是

我们调节补偿是以阳性和阴性细胞群的中心位置对齐为标准,而这两群细胞的分布宽度一般不一样,就像郭版这张图,所以上面分界位置也不一样?
作者: samly0    时间: 2013-4-2 10:08
倪老师,我觉得,如果设FMO是为了解决阴阳性细胞分布宽度不一样的问题,那我是不是用单标管调好补偿后以单阳性细胞群的上缘为界划线门,是不是就不需要FMO管了?我比较赞同版主老师的说法,荧光补偿后背景荧光会增强是为什么要设置FMO对照的原因,但是同时我也不明白,既然补偿已经消除荧光之间的光谱重叠,那么它引起的背景荧光信号的增加,是指使重叠范围增大了导致补偿不足出现的信号么?
作者: niwanmao    时间: 2013-4-2 10:17
samly0 发表于 2013-4-2 10:08
倪老师,我觉得,如果设FMO是为了解决阴阳性细胞分布宽度不一样的问题,那我是不是用单标管调好补偿后以单 ...

我前面说过,如果你是两色,那么你所说的单标管就等于FMO,所以你说的用单标管划门没有错。

但如果是3色(例如FITC/PE/PERCP)呢?例如你用perCP单标管来为PE通道的荧光素设阴性门,那么FITC漏过来的你如何算?如果用FITC单标的设PE的阴性门,PERCP漏过来的如何排除?所以就必须用FMO管,即FITC和PERCP双标的(只有PE扣除掉)的,来设置PE通道的阴性门。
作者: samly0    时间: 2013-4-2 11:00
哦,明白了,谢谢倪老师,我想我的思维模式固化了,在做多色补偿时,都是画散点图用单标管依次调,比如先调FL1通道跟其他通道的补偿,先依次减完FL2/3/4,再调FL2通道,依次减完FL3/4,最后调FL3,减FL4,以为这样子组合就可以全部消除荧光叠加,所以没有从来没有考虑到您说的调FL1与FL2时,FL3漏过来的信号这种情况,真没学到家,惭愧了
作者: niwanmao    时间: 2013-4-2 11:31
samly0 发表于 2013-4-2 11:00
哦,明白了,谢谢倪老师,我想我的思维模式固化了,在做多色补偿时,都是画散点图用单标管依次调, ...

呵呵,那倒不是,主要是现在的荧光越来越多,有时候荧光之间干扰也多起来了,所以FMO对照显得更为重要。

共同学习,共同进步!
作者: niwanmao    时间: 2013-4-2 11:31
samly0 发表于 2013-4-2 11:00
哦,明白了,谢谢倪老师,我想我的思维模式固化了,在做多色补偿时,都是画散点图用单标管依次调, ...

呵呵,那倒不是,主要是现在的荧光越来越多,有时候荧光之间干扰也多起来了,所以FMO对照显得更为重要。

共同学习,共同进步!
作者: 木石织梦    时间: 2013-5-8 09:12
FMO怎么做呢?是不是在染色的时候就备一管除去目的荧光的其它荧光抗体染色,比如(FITC,PE,PE-Cy-7)三染的话,我要划PE荧光的门,要做一管(FITC,PE-Cy-7)上机作为对照,还是说,做3个单染调补偿后,在用Flowjo软件作图的时候,做一张FITC,PE-Cy7的图作为FMO对照?
作者: niwanmao    时间: 2013-5-8 11:30
木石织梦 发表于 2013-5-8 09:12
FMO怎么做呢?是不是在染色的时候就备一管除去目的荧光的其它荧光抗体染色,比如(FITC,PE,PE-Cy-7)三染 ...

要做一管(FITC,PE-Cy-7)上机作为FMO对照
作者: 椴树    时间: 2013-5-13 10:44
niwanmao 发表于 2013-4-2 10:17
我前面说过,如果你是两色,那么你所说的单标管就等于FMO,所以你说的用单标管划门没有错。

但如果是3色 ...

老师 那这样说的话,我FITC和PE有渗漏,但是APC跟它们不一个激发器啊,其实还是相当于2色的?那就不用做额外的FMO了不?
作者: niwanmao    时间: 2013-5-13 11:21
椴树 发表于 2013-5-13 10:44
老师 那这样说的话,我FITC和PE有渗漏,但是APC跟它们不一个激发器啊,其实还是相当于2色的?那就不用做 ...

从理论上说是可以不需要做,但如果严谨起见,多做一个FMO未尝不是一个更好的方法。
作者: 椴树    时间: 2013-5-13 11:23
niwanmao 发表于 2013-5-13 11:21
从理论上说是可以不需要做,但如果严谨起见,多做一个FMO未尝不是一个更好的方法。 ...

恩 好的

作者: fage    时间: 2013-8-14 20:16
嗯 水平好高,涨知识
作者: lin850424    时间: 2013-12-26 15:45
倪老师,按照您的意思,根据上面这个例子,是不是得分这些组
1   blank
2   FITC单标
3   PE单标
4   cy5PE单标
5   cy7PE单标
6   (-)+PE+cy5PE+cy7PE           (FITC的FMO对照)
7    FITC+(-)+cy5PE+cy7PE        (PE的FMO对照)
8    FITC+PE+(-)+cy7PE              (cy5PE的FMO对照)
9    FITC+PE+cy5PE+(-)             (cy7PE的FMO对照)
10  FITC++PE+cy5PE+cy7PE
是需要分这些组吗?还是能简化一下,否则那也太费抗体了吧?
作者: niwanmao    时间: 2013-12-26 16:13
lin850424 发表于 2013-12-26 15:45
倪老师,按照您的意思,根据上面这个例子,是不是得分这些组
1   blank
2   FITC单标

你就第一次调条件时用一下,后面做只要电压恒定、机器状态稳定,就不用做,或者只需要做6-9即可。
作者: sdjjcw    时间: 2014-1-7 11:20
niwanmao 发表于 2013-4-2 10:17
我前面说过,如果你是两色,那么你所说的单标管就等于FMO,所以你说的用单标管划门没有错。

但如果是3色 ...

如果是混合抗体,应该就没法做FMO了吧,悲催,我的CD3/CD16+56是两色混合抗体,当时设置模板的时候,是用正常人血调节的荧光补偿,分群还不错。
作者: niwanmao    时间: 2014-1-7 11:36
sdjjcw 发表于 2014-1-7 11:20
如果是混合抗体,应该就没法做FMO了吧,悲催,我的CD3/CD16 56是两色混合抗体,当时设置模板的时候,是用 ...

你那个分群不好的标本是什么病人,放了几天?
作者: zark_00    时间: 2014-7-13 23:15
正在摸索验证的问题,其中里面有FMO项,倪老师能不能发下一楼的文献,谢谢
作者: zark_00    时间: 2014-7-13 23:20
niwanmao 发表于 2014-1-7 11:36
你那个分群不好的标本是什么病人,放了几天?

正在摸索验证的问题,其中里面有FMO项,倪老师能不能发下一楼的文献,谢谢。

另外请教下,Carryover 到底是什么定义 (携带效应?),在流式中如何检测,我查到有说是将样品用抗体混合液和同型对照混合液分别孵育染色,然后先上同一样本的抗体染色管,再立即上其同型管,看此时同型管目标群体占抗体管相应群体的百分比,请问倪老师找到过有相关文献详细讲解的么,谢谢
作者: niwanmao    时间: 2014-7-14 07:22
zark_00 发表于 2014-07-13 23:20:12


正在摸索验证的问题,其中里面有FMO项,倪老师能不能发下一楼的文献,谢谢。

另外请教下,Carryover 到

参考文献就在一楼那张图上,至于carryover不太清楚,能把你看的那篇文章传上来吗?
作者: 倪shunlan    时间: 2014-7-24 10:53
gcz5340 发表于 2013-4-1 22:09
我觉得:荧光补偿后背景荧光会增强是为什么要设置FMO对照的原因,如图中,CD8阳性群体调完补偿后是一个弥散 ...

哦!有些明白了!
作者: 水念人倦    时间: 2015-9-15 10:44
学习了!
作者: DFL    时间: 2018-5-4 20:00
倪老师好,你说“这种对照可以帮助你衡量其它通道究竟有多少荧光漏到目的通道”,请问补偿不是可以去除荧光逸漏吗?
作者: niwanmao    时间: 2018-5-7 09:17
DFL 发表于 2018-5-4 20:00
倪老师好,你说“这种对照可以帮助你衡量其它通道究竟有多少荧光漏到目的通道”,请问补偿不是可以去除荧光 ...

补偿是可以去除荧光渗漏,但是不可能100%去干净,而且你需要了解,我调到某个值之后,究竟还有多少渗漏的荧光掺杂在这个通道,此时的FMO对照就是干这个用的。
作者: 毛豆24821    时间: 2018-6-28 11:48
samly0 发表于 2013-4-2 10:08
倪老师,我觉得,如果设FMO是为了解决阴阳性细胞分布宽度不一样的问题,那我是不是用单标管调好补偿后以单 ...


同问!对背景荧光的增加不能理解。您现在对这个问题有进展了吗?求赐教
作者: shjfx    时间: 2019-11-20 08:33
请问倪老师,FMO对照中,需要对照的那个marker的荧光抗体减掉,是否需要加对应的同性对照抗体?感觉这样才完备。
作者: tianyang    时间: 2020-6-10 17:05
老师,您好,想问下FMO 对照可以用补偿微球做吗
作者: niwanmao    时间: 2020-6-10 19:43
tianyang 发表于 2020-6-10 17:05
老师,您好,想问下FMO 对照可以用补偿微球做吗

补偿微球做的是补偿。
FMO必须用样本。
作者: 晴儿    时间: 2020-8-14 19:49
niwanmao 发表于 2013-4-1 15:41
单标主要目的是用于调节补偿。
FMO对照的目的是为了在补偿调节完成之后,分析时能够精确设门而做的。 ...

老师,请教一下,分析设门的时候,样本管和FMO管,是不是都是应用补偿之后对比设门呢,还是FMO管不需要应用补偿呢?不太懂




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