PMBC提取的经验及问题讨论

chujindong

最近做了些从人全血中提取PBMC的实验（准备做流式），因为只见过一次示范性的实验，有些问题想跟各位讨论一下。
最开始做这实验时，最看重的向淋巴细胞分离液中加样这一步骤，只要密度梯度离心后效果不好就认为是这一步没做好，做了十几次后发现这一步已经做得不错了，但还是会有做的不好的时候。比如最近几次，有时做出来很好，各层分层十分清晰，细胞量也多。但有几次就做得很差，离心后PBMC层既能看到云雾状细胞，也能看到呈片状的红细胞层。
几次实验对比下来，发现原因有二：一是护士抽血时间比较早，大概在早上六点左右抽好，早上我去实验室开始处理血的时候大概就是九点多，而一般要求采血后2小时之内处理；二是可能由于护士抽血后没有吧血混匀，导致抗凝剂与全血接触不全面，采血后又是垂直放置（应该水平放置）；所以离心后会出现片状红细胞与PBMC层混合，因为有凝血了，这一块是沉不下去的。
而做得好的情况就是新鲜血，并且在我取血后处理前一直水平放置。其他实验条件、方法与做的不好的时候是一样的，所以我分析出来就是这个结果。请大家指教。

chy

我们这里曾做过很多次对比实验。同一个病人，上午抽的血和下午抽的血，在同一时间处理。发现：大多数的病人上午的血和下午的血，得到的细胞几乎一样。排除个别病人凝血厉害的区别比较大。同一个病人，昨天抽的血和今天抽的血，在同一时间处理，得到的细胞也差不多，排除个别病人凝血厉害的区别比较大。同一病人，前天抽的血和今天抽的血，在同一时间处理，前天的血里得到的细胞明显比今天的少。所以，我们一般都是当天或者隔天处理。我们这些做对比实验的血，不是用临床上的血常规的管子，用的是肝素抗凝的，可以装15ML的无菌染色体瓶子。

niwanmao

很好的经验分享。我个人没做过淋巴细胞提取，但这边的研究生做过，感觉应该跟抽血时间没有关系吧。
请有提取经验的朋友们来讨论讨论。

sugarswallow

确实，血液新鲜些，分离效果要好些！分离效果还跟病人血的个体差异有关！还有抽血后是否立即和抗凝剂混匀有关！还有就是将血液滴加在淋巴细胞分离液面上的时候，要把血液和NS或PBS混匀等！
就是这个水平放置，我不知道这样的目的是什么？

niwanmao

学习了

aninawang

最好是新鲜血，象前述描述的这种红细胞混在PBMC层的情况我也遇到过，怀疑是个体的血液不好，还有就是水平离心机最好是慢升慢降，效果会好狠多，一般是2000rpm*20min，国产的ficoll PBMC的获得率不如进口的，国产的分离液PBMC损失比较大。

chujindong

离心速度是多少呢？我们分离血清，用的是12000rpm。
qqsvery 发表于 2011-3-11 10:28

                               
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密度梯度离心，按说明书是400g/min，我使用的是440g/min，1600rpm,30min，效果不错。你说的分离血清，不知你是怎么分的，我查的资料一般用的是1000g/min左右的速度，国内检验科使用3000rpm，这个条件下分出的血清就很好了。我猜测你说的12000rpm是一种小型的离心机吧。但即使是这样，转速也太大了。

chujindong

最好是新鲜血，象前述描述的这种红细胞混在PBMC层的情况我也遇到过，怀疑是个体的血液不好，还有就是水平离 ...
aninawang 发表于 2011-3-11 21:23

                               
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2000rpm*20min似乎是最常用的方法，我用的是sigma的，按说明做还好。离心机比较老了，貌似不能调节“缓升缓降”，这个没办法。

chujindong

回复 sugarswallow 的帖子
深有同感。水平放置的原因是这样的：因为临床上使用的全血采血管都是抗凝剂预处理的，抗凝剂在管壁上分布，为了使抗凝剂与全血充分接触，必须在注入全血后颠倒几次以混匀。水平放置的原因可能也是保证与抗凝剂接触全面；另一方面，如果是垂直放置的话，待处理的时候已经有模糊的分层了，血浆在上，这时候还需要混匀转移，水平放置的话就不会有这个问题。这是我猜测的。

   

chujindong

最近又做了一次。情况是这样：两名病人，第一名采血时间大约在6点，取回后水平放置；第二名采血时间在9点40分，取回后水平放置；约11:30同时处理，两人同时分别将稀释后全血加入淋巴细胞分离液上，同时离心。密度梯度离心后发现，第一名患者标本PBMC层可见少量红细胞，淋巴细胞分离液中可见悬浮细胞团块；第二名患者标本分层清晰，PBMC层无红细胞混杂。
差别表现明显。当然这其中有一干扰因素，即两例标本来自两名病人，不能排除其影响。但我认为主要因素还是采血时间与处理时间间隔的不同：越新鲜的血样越容易成功分离PBMC。