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[磁珠分选] B细胞磁珠阴选

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发表于 2017-12-1 19:04:39 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星已解决
请教各位做过磁珠阴选B细胞的高手,我们刚开始做磁珠阴选B细胞。分选磁珠、磁柱都是用的miltenyi的。获得B细胞后流式检测纯度不高70--80%。分析原因可能是分离的PBMC中混入红细胞,导致加入的磁珠量不足。但是如果增加磁珠剂量似乎每次实验的成本太高了!想请教各位一般10ml全血,分离PBMC后阴选B细胞,加入大约多少ul磁珠?(按大约10ml血获得1*107PBMC计算)
或者说大家获得的PBMC中混有的RBC吗?影响分离效果吗?如何解决?

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磁珠阴选流出红细胞的可能性很小,因为阴选的cocktail中含有Ter-119,足够让红细胞挂在柱上。更可能是你的抗体cocktail效价有问题。 效价降低对于阳选还算可以容忍,但对阴选就不能,因为阴选就是靠强结合(一般靠间标)让所有疑似非目标细胞都挂柱去除,用得率换纯度。一旦效价降低,非目标细胞就会大量混入。 我遇到过这种事情,客户自己买的Treg纯化试剂盒在我们的AutoMACS上表现一塌糊涂,把CD4 T阴选的cocktail换了一瓶就没事 ...
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发表于 2017-12-1 19:04:40 | 显示全部楼层
磁珠阴选流出红细胞的可能性很小,因为阴选的cocktail中含有Ter-119,足够让红细胞挂在柱上。更可能是你的抗体cocktail效价有问题。
效价降低对于阳选还算可以容忍,但对阴选就不能,因为阴选就是靠强结合(一般靠间标)让所有疑似非目标细胞都挂柱去除,用得率换纯度。一旦效价降低,非目标细胞就会大量混入。
我遇到过这种事情,客户自己买的Treg纯化试剂盒在我们的AutoMACS上表现一塌糊涂,把CD4 T阴选的cocktail换了一瓶就没事了。毕竟不是所有代理商都有全程冷链,说不定什么时候就中招。

至于磁珠用量嘛,按我在HKU的经验,在说明书的基础上,用量和体积都减半,也没有问题。

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 楼主| 发表于 2017-12-5 09:53:59 | 显示全部楼层
@miliamlau 看了下说明,我用的里面没有Ter-119。这个 CD235a (GlycophorinA)是不是结合红细胞的,能起到与Ter-119同样的作用?谢谢!! 11.png



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发表于 2017-12-5 10:18:13 | 显示全部楼层
对, CD235a也是用于去除红细胞常用的抗体,一般来说,如果你已经将全血处理为PBMC这一步没有太大问题,都不会因为有残留红细胞而影响磁珠分选的,可能需要找找其他原因,比如分离了PBMC之后清洗的步骤怎样,最好是用足够量的PBS彻底清洗了两遍,这样使血小板去除的更干净一些,血小板很黏,残留过多会使影响磁珠分选效果。另外就是这个血样是否是正常人血液,细胞比例是否有变化,如果有也可以适当调整加试剂的量。调整试剂的量需要将抗体和磁珠按比例增加或减少,不能只改变磁珠的用量,没有抗体连接细胞,只调整磁珠的量没什么意义。
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