JC-1检测线粒体膜电位

周利

大虾们：
        小虾米求救，我最近要检测线粒体膜电位，用的是cayman的盒子，染色说明如下：
         我做的是人骨肉瘤细胞，是个贴壁细胞，它说前一天接种细胞，第二天染色，37℃孵育15-30min，收获细胞上机检测，我不知道如何收获细胞，需要消化吗？还是刮下来？如果消化会对前面的染色有影响吗？
          希望大家帮帮我！

didi_zhou

周利 发表于 2014-6-20 11:13
补偿没有调，我用的机器是贝克曼的FC500，它在调的时候，电压和补偿只能选一个，不能同时调，我上了 ...

也没有谁会同时调的。打开SetupMode，你可以用QuickSet调完电压以后直接点QuickComp调补偿，一管就可以做完，也不用上两次。调补偿的时候用处理组的就好了。
另外用FC500的话使用1、3通道来做JC-1会更好，第三通道是610，补偿更好调。

niwanmao

对于自配试剂的，JC-1一般用DMSO配成1000x储存液(5 mg/ml)。
如果是标记贴壁细胞，需先将JC-1储存液用培养基稀释至5 µg/ml的工作液（稀释时注意边稀释边振荡，以防止沉淀形成），然后再将加了JC-1的培养基加到贴壁细胞中，37℃孵育10分钟或室温15分钟，最后用PBS洗涤两次、胰蛋白酶消化，500 µl PBS重悬，上机分析。

同时给做悬浮细胞的站友提个方案，如果是悬浮细胞，可将悬浮细胞与用培养基稀释至10 µg/ml 的JC-1溶液以1：1混合，最终浓度5 µg/ml，同样37℃孵育10分钟或室温15分钟，最后用PBS洗涤两次，500 µl PBS重悬，上机分析

相关链接：http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/JC1staining.htm

周利

老师，我还想问问，1.我的盒子JC-1是液体的，说明书上有说JC-1的稀释方法，用相应的细胞培养液1：10稀释，盒子里也有Assay Buffer ，我想清洗细胞的时候是不是用这个就可以了？
2. 我是第一次做这个实验，我的盒子里没有做阳性处理的药物，我能不能用5氟尿嘧啶诱导一下，作为阳性对照？

niwanmao

周利 发表于 2014-6-13 09:03
老师，我还想问问，1.我的盒子JC-1是液体的，说明书上有说JC-1的稀释方法，用相应的细胞培养液1：10稀释， ...

1、如果成分跟pbs差不多，也可以用。
2、可以试试。:)

周利

老师，我今天做了一下线粒体膜电位检测，做了2管，一管是正常的细胞，一管是加了NaF 诱导的细胞，同时用JC-1染色，结果如下，两管没有什么变化，您看我的结果合适吗？

niwanmao

周利 发表于 2014-6-18 14:04
老师，我今天做了一下线粒体膜电位检测，做了2管，一管是正常的细胞，一管是加了NaF 诱导的细胞，同时用JC- ...

NaF能够肯定诱导线粒体膜电位降低吗？似乎CCCP用的多吧。

从这两张图看，两者没有区分。

didi_zhou

补偿没调吧。

周利

       补偿没有调，我用的机器是贝克曼的FC500，它在调的时候，电压和补偿只能选一个，不能同时调，我上了两管，一管未处理细胞，一管加了NaF的细胞，我用第一管把细胞调到了对角线上，直接上了第二关，问题有两个，一是图不好看，不是椭圆型的一坨，二是两管没有差别，CCCP我已经订购了，希望拿它处理后会有阳性结果。

周利

今天又做了一下线粒体膜电位检测，有了好的结果，之前的图是没有调补偿惹的祸，谢谢大家的帮助！