认识一下染色指数吧，它会帮助你把流式做得更好

niwanmao

我们需要感谢最近若干年荧光染料技术的进展，让我们在流式抗体搭配时有了更多的荧光染料选择，为多色流式的发展提供了强有力的工具，为复杂细胞群的分析提供了可能。但同时带来的问题是，我们如何选择荧光染料呢？PE还还是APC好呢？下面我们来认识一下我们的帮手——染色指数（Staining Index，SI），它能可靠地衡量阳性群和阴性群之间的分离程度。计算方法如下图：





如果另一个荧光素阳性细胞群的平均荧光强度（MFI）更低，那么SI也会降低，见下面的动图（随着阳性群的左移，SI也会降低）：



还有，如果另一个荧光素产生的阳性细胞群MFI一样，但是阴性群的基底更宽，即意味着变异系数更大（即使阴性细胞群的MFI也是一样的），那么其SI也会降低，见下面的动图（随着阴性群SD增大，SI降低）：




所以，同一克隆的抗体，不同荧光之间比较亮度，可利用SI进行比较。如下图，是BioLgend利用BD LSR II Fortessa™比较同一克隆CD8的三种荧光素排行：




但不同的荧光素亮度还会受到以下因素的影响，例如：
1. 抗体克隆和抗体质量。
2. 荧光素纯度和质量。
3. 荧光素和蛋白比例（f:p比例）。
4. 激光和激光器功率。
5. 使用的长通和带通滤光片。
6. 使用的目的细胞。

因此，我们对于不同公司、不同克隆的抗体，即使用了同样的荧光素，也要用SI进行重新评估，而不是根据现成的排行榜单，因为影响因素很多。不过，由于有了SI这个好帮手，所以，我们也不怕抗体荧光素的亮度问题了，并且SI可帮助我们进行抗体滴定，确定某个批号抗体最佳使用浓度。


编译自Biolegend。

Arcrain

{:soso_e179:}。感谢倪老师的资料。
要想设计最优化的多色方案，仔细参考SI进行选择是必经的一步。它综合反应了所用仪器的性能、实验操作、荧光抗体、细胞抗原这些全部的、所有环节的影响，是最实用的直接衡量最终结果的指标。

tianpaopao

原理明白了，实际操作中要怎么比较呢？有什么软件吗？

小憨

tianpaopao 发表于 2015-7-15 11:15
原理明白了，实际操作中要怎么比较呢？有什么软件吗？

其实这些都是荧光素自身特点，不用自己去测定。你只要在配色的时候注意一下，把低表达的指标配上染色指数高的荧光素，高表达的指标配上染色指数相对较低的。我们实验室有一张染色指数排序的挂图，是BD公司给的，你可以向他们销售要一张挂实验室里，配色的时候拿不准可以查一下

niwanmao

tianpaopao 发表于 2015-7-15 11:15
原理明白了，实际操作中要怎么比较呢？有什么软件吗？

计算染色指数的话，目前似乎只能手工计算。

tianpaopao

小憨 发表于 2015-7-15 16:28
其实这些都是荧光素自身特点，不用自己去测定。你只要在配色的时候注意一下，把低表达的指标配上染色指数 ...

好的，谢谢哦~~

zhang4083

受用，太好了，写的

77609439

对于分群不明显的，比如测定细胞因子的时候也可以用吗？

niwanmao

77609439 发表于 2015-7-24 21:40
对于分群不明显的，比如测定细胞因子的时候也可以用吗？

细胞因子胞内染色，并且有些细胞因子分群不好，此时建议按照推荐的量来吧

cynthia138725

我查到有些说染色指数stain index=D/W，不明白D是两个峰中心间的距离，这两个峰是阳性峰与阴性峰的距离还是发射峰与激发峰的距离，另外W是阴性峰/发射峰的半峰宽吗，与SD有什么数值上的关系呢，谢谢