固定对细胞膜表面蛋白影响

guanyu

倪老师，你好，我想检测不同时相的膜蛋白表达量，用PI染核的话需要破膜，破膜是否会导致膜蛋白离开原本的细胞，这样测出来的某一时相的膜蛋白就不再准确，如果不破膜，在染核前固定细胞增加通透性是否能让PI染核，我咨询过碧云天的顾问，说”细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒“里不含有破膜成份，细胞固定后成为死细胞就能被PI染色；我也考虑过用DAPI染核，可去测流式的时候操作老师说DAPI不行，它的发光原理与PI不同，他也不愿意多说，请教倪老师DAPI是否能用，我的问题该如何解决，谢谢老师

niwanmao

你要检测的膜蛋白是否会受固定、破膜影响，可以先对比测试一下看看就知道了，一般应该没你想象的这么严重。

至于DAPI是不需要破膜的，但是需要紫外光激发，如果你们的流式细胞仪没有紫光激光，就不能用。

至于细胞凋亡试剂盒，那是PI是低浓度的，死细胞膜破了，所以能染，活细胞染不进去的。

guanyu

niwanmao 发表于 2017-11-26 17:43
你要检测的膜蛋白是否会受固定、破膜影响，可以先对比测试一下看看就知道了，一般应该没你想象的这么严重。 ...

首先我必须明确一点您的意思是DAPI的确是可以用作流式中测细胞不同时相比例，我们的是405nm激发光，DAPI的是355，有些偏差，但也可以用；
那我打算这样做一下预实验：
        一组， 膜蛋白标记荧光抗体后用DAPI染核测不同时相膜蛋白表达比例，
        二组，膜蛋白标记荧光抗体后用多聚甲醛固定细胞再用DAPI染核测不同时相膜蛋白比例
以此来分析固定细胞是否影响不同时相膜蛋白测定

guanyu

niwanmao 发表于 2017-11-26 17:43
你要检测的膜蛋白是否会受固定、破膜影响，可以先对比测试一下看看就知道了，一般应该没你想象的这么严重。 ...

固定细胞使细胞膜通透性增加，机制是怎样的，是破坏了膜结构还是仅仅增加了渗透性
PI染核仅仅使用多聚甲醛固定细胞，不用破膜剂处理可以进行染核吗

niwanmao

guanyu 发表于 2017-11-27 16:05
固定细胞使细胞膜通透性增加，机制是怎样的，是破坏了膜结构还是仅仅增加了渗透性
PI染核仅仅使用多聚甲 ...

固定细胞不能使膜通透性增加，这个机制你要理解一下。
只有破膜才能。破膜的机制大多是去污剂，就是将膜表面的大多数胆固醇分子溶解掉，只留下骨架蛋白，从而形成孔洞，方便抗体进入。

guanyu

niwanmao 发表于 2017-11-28 08:06
固定细胞不能使膜通透性增加，这个机制你要理解一下。
只有破膜才能。破膜的机制大多是去污剂，就是将膜 ...

首先万分感谢老师回复
去污剂，例如Triton,我所查到的是它们为两亲性分子，与两亲性分子磷脂，蛋白质的亲水端，疏水端结合而产生作用：而皂素较为温和，与胆固醇结合后将胆固醇移除，形成孔洞。
倪老师，您所说的去污剂将膜表面胆固醇溶解掉，留下骨架蛋白是所有的破膜剂机制，还是皂素的，我想测膜表面蛋白的话不能使其破坏，是不是只能使用皂素了？
固定细胞后染核更容易是因为膜被破坏了吗？
谢谢老师解疑

niwanmao

guanyu 发表于 2017-11-28 08:39
首先万分感谢老师回复
去污剂，例如Triton,我所查到的是它们为两亲性分子，与两亲性分子磷脂，蛋白质 ...

因为首先染胞膜分子，而且经过了固定，所以无论用何种，都是不需要担心的。

如果真过不了自己的心理这一关，那么就用皂素，但是需要有心理准备，皂素破膜能力有限，只能破到细胞膜，破不了核膜。
固定是为了防止蛋白质丢失，把框框固定住了，就丢不掉了。

guanyu

niwanmao 发表于 2017-11-28 09:18
因为首先染胞膜分子，而且经过了固定，所以无论用何种，都是不需要担心的。

如果真过不了自己的心理这一 ...

就是经过固定细胞后，Triton即使与膜上磷脂，蛋白结合形成孔洞，也不会使形成的复合物移除，因为已经经过固定
不知我的理解是否正确

guanyu

niwanmao 发表于 2017-11-28 09:18
因为首先染胞膜分子，而且经过了固定，所以无论用何种，都是不需要担心的。

如果真过不了自己的心理这一 ...

首先要赞扬一下这个网站，我觉得从流式中文网学到了很多知识，解了我很多的疑惑
倪老师帮忙看一下实验步骤可行性
我的实验目的是测定不同时相膜蛋白表达：
首先用连接荧光素的抗体与表面蛋白反应，然后洗去多余抗体，接着用多聚甲醛固定细胞（固定细胞一是为了使细胞停止在其所处的时相，二是为了使膜蛋白处在原本的位置，防止跑到其他时相细胞膜上）后，再破膜用PI染核，上流式分析

niwanmao

guanyu 发表于 2017-11-28 10:17
首先要赞扬一下这个网站，我觉得从流式中文网学到了很多知识，解了我很多的疑惑
倪老师帮忙看一下 ...

可以。