为什么镜下观察细胞增殖很明显，cfse只有部分出来了增殖...

一僧化画

做了四组实验  第1组仅有小鼠脾脏淋巴细胞 第2、3、4组为小鼠脾脏淋巴细胞与msc不同条件下共培养，ConA做刺激剂，（第一天msc铺板，第二天将刚刚提的原代淋巴细胞cfse染色后与msc共培养，培养2-3天后收淋巴细胞上流式）共培养2天后光镜下观察如下，接着是cfse染色后流式结果,

第1组还可以光镜下和流式都表现为增殖,  而第2 3组光镜下明明显示增殖很明显,流式却是单峰图像,已经重复两次都是这样，真是百思不得其解,求有经验的各位大神指点啊

光镜下增殖情况

cfse流式检测

一僧化画

是不是共培养的msc对淋巴细胞染的cfse有影响？

niwanmao

1、2、3的FSC和SSC散点图能否晒出来看看？

一僧化画

niwanmao

一僧化画 发表于 2018-1-4 12:08

（1）1 和4 的散点图很像，但是光镜下面完全不同，这有点奇怪。还有光镜下的黑色一团都是什么？为什么4没有？
（2）至于为什么共培养之后出不来，应该是和共培养不同的，你描述一下你使用的CFSE浓度和培养时间看。另外，如果有机会重试，将父代CFSE峰调到10E4试试。

一僧化画

1）1和4散点图很像，光景完全不同，这个我也很不解
2）光镜下黑色的一团应该是淋巴细胞增殖的集落，4组加了抑制增殖的因素，所以没有出现明显增殖的集落
3）培养具体步骤如下：1）取小鼠脾脏，研磨，70um滤网过滤，淋巴细胞分离液离心，取中间层细胞混悬于1640培养基离心得淋巴细胞 2）计数，重悬 密度大概为1-5＊10*6/ml ，pbs洗两遍，加cfse,浓度为2uM,常温避光孵育10min，5倍预冷的完全培养基终止染色，冰上孵育5min，pbs洗3遍  3）所得细胞用含10%血清的完全培养基培养2-3天（234组与前一天铺板的msc共培养的，里面加了不同的细胞因子，4是抑制淋巴细胞增殖的）

一僧化画

好的好的，下次调一下电压把父代峰调高一些
也就是 共培养的 msc 会吸收淋巴细胞的染色么？

niwanmao

一僧化画 发表于 2018-1-5 13:24
好的好的，下次调一下电压把父代峰调高一些
也就是 共培养的 msc 会吸收淋巴细胞的染色么？ ...

CFSE的染色肯定是没有选择性的，也会染MSC，但是只要终浓度一致，应该不至于出现这么大差异。
我在想，你这里的CFSE终浓度可以想办法变变看，培养2～3天的话，可以再低一点。

whyxa

我不知道你的MSC是什么细胞，看你样子是个贴壁细胞，做混合淋巴细胞培养分两种一种是双向混合淋巴细胞，一种是单向，如果你是做单向呢，MSC应该用丝裂霉素C处理一下，使MSC细胞不分裂，但这个我觉得不是影响你现在结果的原因，但是按理论MSC是没染CFSE的，如果也被当作淋巴细胞去跑流式，他就被认为是增殖的细胞。

所以我建议你一减低淋巴细胞密度，延长培养时间至5-7days，二是圈门的时候尽可能的增加CD3marker， 确保是观察到的是淋巴细胞群的增殖变化。

一僧化画

whyxa 发表于 2018-1-6 07:52
我不知道你的MSC是什么细胞，看你样子是个贴壁细胞，做混合淋巴细胞培养分两种一种是双向混合淋巴细胞，一 ...

确实是个好建议！下次上机的时候也染一下CD3 marker,在培养时间上也调整一下试试！