雪貂PBMC分离

luyexianzong

1. 低温裂解   用4-8˚c的lysis buffer （借鉴Sigma配方1.65g NH4Cl, 0.24g NaHCO3, 40ul 0.5M EDTA, addwater to 200ml）裂解红细胞。在冰浴上裂时，细胞裂解15min后经HBSS洗涤两次后仍有部分明显的红细胞残留。
结果：细胞含量约4x10^5,  活细胞比例80%。（雪貂每次仅能采0.2-0.4ml血）

2常温裂解

用上述lysis buffer ，将buffer恢复到室温，再裂解红细胞。
在室温裂解红细胞时，细胞裂解15min后经HBSS洗涤两次后仍有部红细胞残留。
若室温裂解红细胞时，细胞裂解25min后经HBSS洗涤两次无红细胞残留，但活细胞比例显著下降。降至50%以下。



问题： 1）少量残留红细胞是否影响后续检测（检测目标为一般的细胞分型，CD4,8,B，DC, Granulocyte）。
2）活细胞数太少是否显著影响最终操作步骤完成后的活细胞数。后续操作步骤有： Fc封闭，表面marker染色，固定／渗透后内部marker染色。

niwanmao

1、有红细胞残留，可通过FSC/SSC排除掉。
2、死细胞，可通过在染色完成，上机之前，100ul样本中加入10ul 20ug/ml的PI染液，1分钟上机获取，分析时选PI阴性的活细胞即可。

luyexianzong

niwanmao 发表于 2018-1-13 13:18
1、有红细胞残留，可通过FSC/SSC排除掉。
2、死细胞，可通过在染色完成，上机之前，100ul样本中加入10ul 20 ...

多谢多谢！雪貂的全血裂解比较麻烦。

niwanmao

luyexianzong 发表于 2018-1-13 13:43
多谢多谢！雪貂的全血裂解比较麻烦。

你们要检测雪貂的免疫功能？话说雪貂的抗体有卖吗？还是用其它种属的交叉反应？

ghqiu09

如果颜色够用的话，加一个CD45，这样即使有少量的红细胞也不影响。通过反圈门的方法在圈淋巴细胞，而且这样分析得到的数据也稳定，不受破红效果影响。

luyexianzong

niwanmao 发表于 2018-1-13 18:40
你们要检测雪貂的免疫功能？话说雪貂的抗体有卖吗？还是用其它种属的交叉反应？ ...

是的。检测部分免疫功能。

luyexianzong

ghqiu09 发表于 2018-1-15 10:18
如果颜色够用的话，加一个CD45，这样即使有少量的红细胞也不影响。通过反圈门的方法在圈淋巴细胞，而且这样 ...

多谢！这个建议好！