流式荧光补偿和FMO对照

marvelwong

1）我想请问一下，我的4标（CD45-PerCp, CD117-APC, Ly6A/E-FITC, CD309-PE）加细胞死活染料（V450）。请问这个需要怎么补偿？

2）FITC和PE补偿的时候，上FITC单染管调PE补偿，那上PE单染管还需不需要调FITC补偿？

3）还有就是APC和PerCP虽然说是不同激发光，理论说不需要补偿，可是试剂发现还是会有好多溢漏，所以这个还是需要补偿吗？

4）4色的FMO对照就是标4个管子，每个管子缺一个抗体，也不加ISO，是这样子吗？
谢谢。

niwanmao

1、V450死活染料与其它通道没有补偿，所以不用做补偿管，其它几管，还得看你目的要检测什么指标，如果你是要用CD45设门，那么只需设置：
CD45、CD117、CD309
CD45、CD117、Ly6C/E
CD45、CD309、Ly6C/E
2、见上
3、理论不需要，但实际上还需要看仪器。
4、不用Isotype，但建议事先进行Fc Blocking。

marvelwong

niwanmao 发表于 2018-5-7 19:35
1、V450死活染料与其它通道没有补偿，所以不用做补偿管，其它几管，还得看你目的要检测什么指标，如果你是 ...

谢谢倪老师。
1）问题1的回答没有看懂。
先用CD45-/dim CD117+的设门选定细胞群。
2）针对问题3），我使用的仪器是BD FACSCanto。 实际在使用微球做补偿的时候，APC，PerCP和PE三者之间存在溢漏。

niwanmao

marvelwong 发表于 2018-5-7 19:48
谢谢倪老师。
1）问题1的回答没有看懂。
先用CD45-/dim CD117+的设门选定细胞群。

不是让你选择那类细胞，而是通过那三管FMO对照，依次调节未加抗体通道的补偿渗漏。

marvelwong

niwanmao 发表于 2018-5-8 13:52
不是让你选择那类细胞，而是通过那三管FMO对照，依次调节未加抗体通道的补偿渗漏。 ...

好的，谢谢倪老师。
还有一个问题，我的细胞分群不明显而且全血中的含量很低，除了CD45，其他抗体的阳性率都很低，我可不可以用微球来替代细胞做FMO对照？
或者是不是只能替换抗体，使用同样荧光素和isotype的，但表达含量较高的分子抗体？谢谢。

niwanmao

marvelwong 发表于 2018-5-9 18:08
好的，谢谢倪老师。
还有一个问题，我的细胞分群不明显而且全血中的含量很低，除了CD45，其他抗体的阳性 ...

同样荧光素、同样亚型的替换抗体，是用于调节补偿，不是做FMO的。
按照你所说的，你的实验目的是选择CD45-/dim CD117+的原始细胞，那么说明最后只需要分析Ly6C/E和CD309的表达，所以FMO就做两管：
CD45、CD117、CD309
CD45、CD117、Ly6C/E
用这两管设置出依次设置Ly6C/E、CD309的Marker位置，最后上实验管，就可以正确测出两个标记的表达率。
但是事先必须进行Fc Blocking，可用Fc Blocking Solution，也可以用BSA

marvelwong

niwanmao 发表于 2018-5-10 07:56
同样荧光素、同样亚型的替换抗体，是用于调节补偿，不是做FMO的。
按照你所说的，你的实验目的是选择CD45 ...

好的，十分感谢倪老师的解答。

荷兰西瓜

niwanmao 发表于 2018-5-7 19:35
1、V450死活染料与其它通道没有补偿，所以不用做补偿管，其它几管，还得看你目的要检测什么指标，如果你是 ...

请问一下老师，为什么激发光不同理论上不需要调补偿呢，这种情况下发射光谱有重叠也不需要调补偿吗？为什么呢？

niwanmao

荷兰西瓜 发表于 2021-2-2 20:46
请问一下老师，为什么激发光不同理论上不需要调补偿呢，这种情况下发射光谱有重叠也不需要调补偿吗？为什 ...

不是绝对。
而是有些通道不需要，例如紫光通道和红光通道，基本上没有。
但是有些通道是需要的，例如红光的APC-cy7和蓝光的PE-cy7或PE-cy5.5之间，有时候就需要调节补偿。