细胞凋亡检测，流式如何做到全覆盖？

niwanmao

凋亡，又叫程序性细胞死亡，是正常发育和人体细胞平衡的一种精细调节方式。凋亡与细胞坏死不同，后者是一种突发性的细胞死亡，非生理性的。
如果发生凋亡调节机制的异常，通常会导致癌症、自身免疫性疾病或退化性疾病。

凋亡在形态上主要表现为细胞皱缩、细胞渗透性增高、膜不对称性改变、染色质浓缩、DNA片段化、细胞出泡等，发生凋亡的细胞最后通过巨噬细胞胞吞作用清除。

没有一个指标可以明确细胞死亡的性质，因此，利用流式细胞术的多参数能力，可在一个样本中同时进行多种指标检测，揭示细胞死亡的性质。

从凋亡的早期、中期到晚期，在流式上都有相应的方法可用枟检测。

1、早期凋亡：
线粒体膜电位

JC-1是一种广泛使用的线粒体膜电位检测阳离子染料，它可进入带负电荷的线粒体内聚积形成聚集体，并488nm荧光激发，发出以红光为主的光谱，故在FL1/FL2散点图上，位于双阳性区域（见下图左侧小图）。在凋亡早期，线粒体膜电位会发生下降，此时，JC-1解离为单体，发出绿光，故此时在FL1/FL2散点图可看到一类FL1增强而FL2明显下降的细胞（见下图右侧小图）。详细protocol参见论坛：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3549-1-1.html




DiIC1(5) (1,1’3,3,3’3’-hexamethylindocarbocynanine iodide)是另一种阳离子线粒体膜电位染料，635nm激发，发红光，当线粒体膜电位降低时，可出现荧光强度降低。DiIC1(5) 通常在APC通道检测，所以比较容易与其它指标一起检测。
MitoTracker是另一种商品化线粒体膜电位探针，488nm激发，发红光，主要在PE通道检测，同样在膜电位降低时荧光强度发生降低。


2、中期凋亡：
（1）Caspase检测
细胞内蛋白酶的级联活化，是凋亡的一个重要性标志，这些蛋白酶主要是caspase。caspase开始以非活化的pro-caspase状态存在，当凋亡发生时，可被剪切成活化状态。活化状态的caspase酶可使没有荧光的caspase底物发出荧光。
目前检测的caspase种类主要是3和7，当然，1、2、8、10、11、12、13也有，在此不详述，参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html
下图是Jurkat细胞用staurosporine处理后诱导的凋亡增多，可见caspase-3底物荧光增高。



详细方法参见论坛：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-192-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3111-1-1.html


（2）膜渗透性分析
一些单聚体染料，例如PO-PRO（405nm激发）、YO-PRO-1（488nm激发）、TO-PRO-3（635nm激发）等，可透入凋亡的细胞膜，结合只能染死细胞的染料（例如PI或7-AAD等），就可以区分出凋亡和坏死。
如下图，右下象限是凋亡，右上象限是坏死。



（3）膜对称性分析
随着凋亡的进行，膜对称性开始丧失，磷脂酰丝氨酸（PS）一般位于活细胞膜内测，对称性的消失意味着PS随膜翻转而暴露于膜外侧，从而可被Annexin V检测到。不过Annexin V的结合依赖于钙离子和镁离子，所以你在染色缓冲液中记得要加入这两种离子。



3、末期凋亡：
（1）细胞周期测SubG1峰，可使用PI、7-AAD、Hoechst33342等染料。
详细方法参见：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3496-1-1.html

（2）TUNEL分析
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）-dUTP标记，主要是将TdT掺入断裂DNA的末端，实现检测末期凋亡。



详细protocol参见：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-198-1-1.html

王师傅

最近做了线粒体膜电位的JC-1，早鲷晚凋的Annexin V/PI，看过老师的讲解后打算再做caspase检测

418786804

老师您好，请问为什么 实用流式细胞术彩色图谱上写的caspases-3是早早期凋亡，而本文中提到是中期凋亡呢。

niwanmao

418786804 发表于 2018-7-3 16:01
老师您好，请问为什么 实用流式细胞术彩色图谱上写的caspases-3是早早期凋亡，而本文中提到是中期凋亡呢。 ...

你看一下http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html 帖子中的这张模式图就了解了。

418786804

niwanmao 发表于 2018-7-4 08:15
你看一下http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html 帖子中的这张模式图就了解了。 ...

谢谢老师，已学习