小鼠脾脏淋巴细胞亚型

xinxinquanquan

请问小鼠脾脏碾碎后，收集悬液使用红细胞裂解液进行裂红时，裂红的时间和红细胞裂解液的用量怎么判断，谢谢。

niwanmao

氯化铵裂解液一般用10倍以上体积，裂10～15分钟。

xinxinquanquan

我用的产品主要成分也是氯化铵，但说明书介绍3倍体积，5分钟就可以了，但这样做效果不好，是不是应该换试剂？说明书：在血液样品中加入3倍体积红细胞裂解液 （例如，300 μl血液加入900 μl红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次 ，  10000rpm离心1分钟（若是离心机最高转速不允许，可以3000rpm离心5分钟），吸去上清，留下白细胞沉淀进行后续操作。

niwanmao

xinxinquanquan 发表于 2018-9-21 15:36
我用的产品主要成分也是氯化铵，但说明书介绍3倍体积，5分钟就可以了，但这样做效果不好，是不是应该换试剂 ...

3倍裂不好 的。离心速度太高了，2000～3000差不多了。

ghqiu09

我之前一般都是用红细胞裂解液直接重悬，然后室温放三五分钟就够了，裂完全了离心之后沉淀就是白色的，会有一点红细胞在最上层

yahuicheng

我用的是BD的红细胞裂解液，稀释成1倍的，然后加2ml裂解8-10min就行了

tiger

xinxinquanquan 发表于 2018-9-21 15:36
我用的产品主要成分也是氯化铵，但说明书介绍3倍体积，5分钟就可以了，但这样做效果不好，是不是应该换试剂 ...

从你说的晴况来看，问题出来离心上。离心力太大了，细胞可能碎了，240G，别超过300G效果比较好。你可以裂解后不离心，直接上机看看细胞的形态，就知道是什么问题了。

xinxinquanquan

yahuicheng 发表于 2018-9-25 08:07
我用的是BD的红细胞裂解液，稀释成1倍的，然后加2ml裂解8-10min就行了

谢谢，我之前也用过BD的10X红细胞裂解液裂解外周血红细胞，但发现效果不好后就没有继续使用这款试剂了

xinxinquanquan

niwanmao 发表于 2018-9-21 15:39
3倍裂不好 的。离心速度太高了，2000～3000差不多了。

确实如老师所说，2-3倍裂解效果不佳，5倍以上裂解15分钟效果，1800-2000rpm 5分钟效果还可以，非常感谢老师

xinxinquanquan

tiger 发表于 2018-9-25 09:45
从你说的晴况来看，问题出来离心上。离心力太大了，细胞可能碎了，240G，别超过300G效果比较好。你可以裂 ...

谢谢你的意见，发现离心力确实不能太大