小鼠脾脏淋巴细胞亚型相关问题

zaqwer

请教各位前辈，小弟最近在做小鼠脾脏淋巴细胞检测，使用正常小鼠脾脏，经过研磨，淋巴细胞分离液分离，孵育抗体（抗体用5ug/ml）等步骤后上机检测，检测结果如图。之前看到别人做的CD3+CD4-CD8-细胞占比一般在10%以内，但是我做出来有接近30%，请问有前辈遇到过这种问题么？是使用抗体量太少了么？谢谢！

niwanmao

这个跟你的CD3分不开有关，有较多的CD3－细胞干扰。

zaqwer

niwanmao 发表于 2018-11-1 16:58
这个跟你的CD3分不开有关，有较多的CD3－细胞干扰。

请问一下老师，是我用的抗体浓度太低了么？还是说CD3抗体的荧光太弱了分不开呢？因为我CD4和CD8抗体的用量和CD3的一样的，谢谢老师

ghqiu09

如果你没有别的什么要求的话，研磨后的脾脏用红细胞裂解液破个2-3分钟就够了，然后离心能看到破红的效果。我们一般比较关注的是CD4或者CD8单阳性的细胞，C57小鼠的CD4和CD8比列分别在20%和10%左右。对于其他的细胞个人觉得不需要去纠结比例。

zaqwer

ghqiu09 发表于 2018-11-1 17:34
如果你没有别的什么要求的话，研磨后的脾脏用红细胞裂解液破个2-3分钟就够了，然后离心能看到破红的效果。 ...

那请问前辈需要做密度梯度离心提取淋巴细胞么？还是裂红后直接加阻断抗体然后孵育CD3/CD4/CD8抗体呢？您说的那个比例是提取的淋巴细胞的比例还是整个脾脏研磨后细胞悬液的呢？谢谢前辈指教！

liuruiluna

你的FSC SSC 图发出来看一下

niwanmao

zaqwer 发表于 2018-11-1 17:10
请问一下老师，是我用的抗体浓度太低了么？还是说CD3抗体的荧光太弱了分不开呢？因为我CD4和CD8抗体的用 ...

你说的原因均有可能，抗体用量，不是说跟其它抗体一样就没问题，而是每种抗体有每种抗体最佳用量。另外细胞状态也会影响分群效果。

zaqwer

liuruiluna 发表于 2018-11-1 22:34
你的FSC SSC 图发出来看一下

zaqwer

niwanmao 发表于 2018-11-2 10:14
你说的原因均有可能，抗体用量，不是说跟其它抗体一样就没问题，而是每种抗体有每种抗体最佳用量。另外细 ...

老师，我今天重新做了一次，CD3、CD4、CD8抗体使用量均为1ug(100ul体系)，CD4-CD8-细胞比例明显减少了，但是感觉CD3细胞群还是分不开，是因为这个抗体的荧光比较弱造成的吗？谢谢老师！

niwanmao

zaqwer 发表于 2018-11-2 17:35
老师，我今天重新做了一次，CD3、CD4、CD8抗体使用量均为1ug(100ul体系)，CD4-CD8-细胞比例明显减少了， ...

CD3的用量再做个梯度，如果每个梯度都无法分开，说明确实是抗体荧光素弱的问题。
不过目前这个图基本可用。