流式实验具体步骤请教

XY星雨XY · 发表于 2018-11-14 11:17:24

本帖最后由 XY星雨XY 于 2018-11-14 14:37 编辑

大家好！请教下关于流式的问题，准备用流式测定血小板活化，即检测CD62P的表达。图片中是文献的方法和结果，不太明白：测定CD62P表达，只用anti-CD62P-PE一个抗体不可以吗？为何还要用anti-CD42b-FITC这个抗体呢？另外结果中材料组和阳性对照组差不多，感觉不太靠谱呢？还有就是最后用的Mouse IgG-PE这个同型对照，具体实验过程中该如何添加呢？

下面是我的实验方案，不知道是否合理，第一次做不太懂，还望大神们指导一二！

1、从医院采集新鲜柠檬酸抗凝全血，100g离心5min。

2、收集上清富含血小板血浆于离心管中，带回实验室中（路程需20min），在实验室用PBS按体积比1:1稀释过程是否需要低温？

3、血小板悬液90μL与10μL不同浓度悬浮在PBS里的六种超顺磁氧化铁纳米材料孵育30min。室温？37度？

4、孵育后，取10μL的混合液稀释于90μL HEPES缓冲液中。（做3个平行，共取30μL，分别稀释，或者更多平行？）

5、避光加入5μL anti-CD62P-PE和5μL anti-CD42b-FITC（是否需要低温，可否只加一种抗体）

6、流式测定血小板激活的标志物CD62P（P-选择素）的表达量。

注：阳性对照为牛凝血酶（1U/mL，溶解在PBS里？）、阴性对照为PBS，处理同样品组。

这里涉及双阳、双阴和单阴吗

文献里鼠IgG-PE作为非特异性结合对照，我该怎么设置呢？

求大神指导！多谢啦！

sunny2829 · 发表于 2018-11-15 11:10:52

2、过程是否需要低温？考虑温度对血小板活化的影响，影响大的话，运输和保存则尽量低温。
3、血小板悬液90μL与10μL不同浓度悬浮在PBS里的六种超顺磁氧化铁纳米材料孵育30min。室温？37度？同2，根据影响以及活化效果决定的。可查阅文献。同时需加入阴性对照，阳性对照，同时孵育。同8个样本。
4、孵育后，取10μL的混合液稀释于90μL HEPES缓冲液中。（做3个平行，共取30μL，分别稀释，或者更多平行？）2个平行即可，一个用于同型对照：anti-CD42b-FITC+IgG-PE，一个用于CD62p检测：anti-CD62P-PE+anti-CD42b-FITC。另外，阳性对照需要增加2个平行，用于FITC和PE单染，用于调节补偿。
5、避光加入5μL anti-CD62P-PE和5μL anti-CD42b-FITC（是否需要低温，可否只加一种抗体），4℃孵育30min，室温10-15min，二者均可。CD42b是血小板膜糖蛋白，流式检测时，可根据CD42b圈选血小板，排除碎片等干扰。建议进行染色。
6、流式测定血小板激活的标志物CD62P（P-选择素）的表达量。
通过单染，调节补偿
样本管，圈选CD42b血小板，通过同型，获得样本CD62P的比例。