结肠固有淋巴细胞的treg细胞染色问题

chenmj363

各位老师好，最近我做结肠固有淋巴细胞的流式测treg细胞含量。通过剪碎BALB/C小鼠结肠组织，消化酶消化后，40um的滤膜滤过获得单细胞悬液。然后使用不同浓度percoll离心20分钟，获取中间层淋巴细胞。通过孵育方法，标记表面抗体cd4,cd25,固定破膜后，标记foxp3。但是cd4,cd25始终染色不上。请问是固定破膜问题，还是消化酶的影响呢？结果如图，谢谢老师~

niwanmao

确实都没染上。
小细胞那里的表达如何？三管的分组情况如何。
另外，这些抗体是否都买对了？

chenmj363

niwanmao 发表于 2019-4-14 11:36
确实都没染上。
小细胞那里的表达如何？三管的分组情况如何。
另外，这些抗体是否都买对了？ ...

老师好，三管都是预实验。都是正常小鼠的结肠组织~小细胞指的是？买的是bd公司小鼠的抗体~

chenmj363

niwanmao 发表于 2019-4-14 11:36
确实都没染上。
小细胞那里的表达如何？三管的分组情况如何。
另外，这些抗体是否都买对了？ ...

这个是我订的cd4抗体~

niwanmao

chenmj363 发表于 2019-4-14 12:19
老师好，三管都是预实验。都是正常小鼠的结肠组织~小细胞指的是？买的是bd公司小鼠的抗体~ ...

小细胞指的是你圈的这些细胞左边那些，那些是否有CD3+细胞？

chenmj363

niwanmao 发表于 2019-4-14 13:38
小细胞指的是你圈的这些细胞左边那些，那些是否有CD3+细胞？

好的，我明天去问问流式老师~

chenmj363

niwanmao 发表于 2019-4-14 13:38
小细胞指的是你圈的这些细胞左边那些，那些是否有CD3+细胞？

老师，如果小细胞区域有染色，会是什么原因呢~

niwanmao

chenmj363 发表于 2019-4-14 15:48
老师，如果小细胞区域有染色，会是什么原因呢~

如果小细胞有，说明圈门圈错了。
如果都没有，说明确实没染上。抗体出问题的概率偏低，可能需从细胞制备上找问题。

chenmj363

niwanmao 发表于 2019-4-14 13:38
小细胞指的是你圈的这些细胞左边那些，那些是否有CD3+细胞？

老师好，我把区域调节到淋巴细胞区域，可以看到cd4,cd25的染色情况，但是从图中判断染色情况不是特别理想~

tiger

chenmj363 发表于 2019-4-15 16:07
老师好，我把区域调节到淋巴细胞区域，可以看到cd4,cd25的染色情况，但是从图中判断染色情况不是特别理想 ...

不要用percoll分离，加CD45，用CD45圈淋巴细胞。