CD45-PerPC-Cy5.5试剂测试全血，出现强荧光SSC弱的散点图数据？

zhangjuanLAY

用自己标记的CD45-PerPC-Cy5.5在BD C6上检测全血，散点图数据为什么会出现大量SSC信号弱但应该很强的数据？
细胞碎片出现强荧光标记

niwanmao

这看上去更像是样本处理问题似的。是不是裂解液问题？

zhangjuanLAY

niwanmao 发表于 2019-5-22 17:59
这看上去更像是样本处理问题似的。是不是裂解液问题？

倪老师，我用的是同样的溶血剂处理的全血，做了两次都是这样的结果，BD的试剂没有出现这种现象。

Jeff

自己标记的流式抗体？会不会是荧光直接与细胞结合了呢？

niwanmao

zhangjuanLAY 发表于 2019-5-23 12:06
倪老师，我用的是同样的溶血剂处理的全血，做了两次都是这样的结果，BD的试剂没有出现这种现象。 ...

挺难找原因的，如果多次重复均如何，就感觉是不是你的抗体导致了大多数细胞碎掉了，只标记了少数细胞？

zhangjuanLAY

niwanmao 发表于 2019-5-26 19:56
挺难找原因的，如果多次重复均如何，就感觉是不是你的抗体导致了大多数细胞碎掉了，只标记了少数细胞？ ...

多次重复都是这样的
如果考虑是抗体的原因，那我试试直接加抗体与血液样本孵育再上机测试

zhangjuanLAY

niwanmao 发表于 2019-5-26 19:56
挺难找原因的，如果多次重复均如何，就感觉是不是你的抗体导致了大多数细胞碎掉了，只标记了少数细胞？ ...

尝试直接用PerCP-Cy5.5串联染料标记细胞，荧光信号比自制CD45-PerCP-Cy5.5的还要强，但是也没有出现散射信号弱，荧光信号强的细胞群。单独用CD45标记细胞，与空白没有太大区别。
另外自己标记的抗体上机检测时阴性和阳性细胞根本分不开。

我想成大牛

zhangjuanLAY 发表于 2019-6-6 09:38
尝试直接用PerCP-Cy5.5串联染料标记细胞，荧光信号比自制CD45-PerCP-Cy5.5的还要强，但是也没有出现散射信 ...

会不会是你的标记过程中对Percp-CY5.5有影响,使cy5.5脱落，导致第一次的图中的信号完全是Percp的信号？另外，最后标记完成后是否置换保存buffer,buffer的条件是否对细胞有影响？最后一个猜测，是不是自制试剂处理的样品上机时细胞及碎片太多，导致SSC信号降低？

zhangjuanLAY

我想成大牛 发表于 2019-6-6 10:37
会不会是你的标记过程中对Percp-CY5.5有影响,使cy5.5脱落，导致第一次的图中的信号完全是Percp的信号？另 ...

我也觉得是串联染料降解导致的，不过没想到怎么解决这个问题。我买了商品化的PerCP-Cy5.5试剂盒进行标记，是没有问题的。
保存缓冲液是：PBS-EDTA
有什么可以改善的建议吗？

niwanmao

zhangjuanLAY 发表于 2019-6-6 12:19
我也觉得是串联染料降解导致的，不过没想到怎么解决这个问题。我买了商品化的PerCP-Cy5.5试剂盒进行标记 ...

即使荧光标不上，也不应该SSC也不出来啊，这是我疑惑的地方。因为粒细胞SSC很大的，你看都缩在SSC压缩的区域，这是不正常的。