间接荧光标记法具体步骤

doctor庞

各位前辈好！我想用流式测胞内蛋白，由于没有直标的抗体，所以用间接荧光标记法，想知道破膜以后加抗体的具体步骤，谢谢！

niwanmao

一般说来，建议你胞内的蛋白尽可能采用直标。我个人觉得，胞内标记直标就已经很难做到稳定，间标就更难了，容易使你的实验陷入困难。
其实，即使没有直标抗体，通过购买荧光标记kit，也是很容易将一个抗体标记上荧光的，只是需要额外增加成本。

如果确实要做，大致的步骤就是：固定－>破膜－>一抗孵育20－30分钟－>洗涤－>二抗孵育20－30分钟－>洗涤。

doctor庞

niwanmao 发表于 2012-1-3 19:16

                               
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一般说来，建议你胞内的蛋白尽可能采用直标。我个人觉得，胞内标记直标就已经很难做到稳定，间标就更难了， ...

非常感谢！想再问一下，荧光标记kit具体怎么操作？需要买什么试剂？对这个还不太了解

niwanmao

doctor庞 发表于 2012-1-3 23:13

                               
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非常感谢！想再问一下，荧光标记kit具体怎么操作？需要买什么试剂？对这个还不太了解 ...

以前看到一个专业的教程，国外的，有点忘记了。只能在google随便帮你搜一下，看到这个似乎比较简便，而且有视频教程。
产品：http://www.innovabiosciences.com ... y-antibody-rpe.html
视频教程：http://www.innovabiosciences.com ... -demonstration.html

doctor庞

niwanmao 发表于 2012-1-4 08:30

                               
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以前看到一个专业的教程，国外的，有点忘记了。只能在google随便帮你搜一下，看到这个似乎比较简便，而且 ...

谢谢！很受益

lxk47640

niwanmao 发表于 2012-1-3 19:16
一般说来，建议你胞内的蛋白尽可能采用直标。我个人觉得，胞内标记直标就已经很难做到稳定，间标就更难了， ...

问一个问题，这里如果检测胞内分子用二抗的话。在一抗孵育的时候kit里说是在100ul 破膜洗液里孵育，那二抗是在洗液里孵育，还是PBS（Stain buffer）里孵育

niwanmao

lxk47640 发表于 2019-5-16 15:29
问一个问题，这里如果检测胞内分子用二抗的话。在一抗孵育的时候kit里说是在100ul 破膜洗液里孵育，那二 ...

已固定破膜了，二抗可以用PBS孵育，但是如果跟破膜剂孵育可能更好。