流式检测细胞色素C和Smac/DIABLO

niwanmao

这是2012年7月份Plos One上的一篇文章《Application of Flow Cytometry to Determine Differential Redistribution of Cytochrome c and Smac/DIABLO from Mitochondria during Cell Death Signaling》重点讨论一下文章里面用流式来检测cyto c和smac的方法，借鉴一下。

不过看了整体方法，个人觉得会差异很大，因为需要破质膜，用的是间标，而且孵育时间需要两个晚上，要做好不容易，从下面这幅图中也看的出来，检测时细胞状态整体好的不多，而且分群也不理想。

细胞类型：143B和HeLa细胞
细胞诱导凋亡方式：100nM或300nM STS（星形孢子素）
抗体标记步骤：
1、胰酶处理六孔板细胞，贴壁的和不贴壁的细胞均收集。洗涤、重悬。
2、调整细胞数量，使之一致，收集1×10E5细胞，1100转/分，离心5分钟。去上清。（流式中文网注：这里1×10E5的细胞感觉过少，可能离心后剩下不多，从实验结果图上也可以看的出来，似乎细胞数量不多；另外，这里建议再用PBS洗涤1-2次，以充分去除培养基)
3、去除上清后的细胞用100μL洋地黄皂甙裂解液重悬（50 μg/ml digitonin; 100 mM KCl；用1×PBS配制），用枪头轻轻吹打细胞，然后室温作用5分钟。这一步是对质膜进行破膜处理。
4、用100μL 3.5％的多聚甲醛室温固定30分钟。
5、离心去上清，用100μL 1×PBS重悬，然后与100μL blocking buffer作用30分钟（3％小牛血清白蛋白，0.05％ saponin，用1×PBS配制）
6、离心去上清，加入一抗：anti-cytochrome c (BD Pharmingen, 1：200) 、rat anti-Smac/DIABLO (Calbiochem, 1：100）,4℃孵育过夜。
7、加入二抗anti-mouse Spectral Red (Santa Cruz Biotechnology, USA) for cyt c和anti-rat Alexa 488 (Invitrogen,USA) for Smac（均为1：200），4℃孵育过夜。
8、1×PBS洗涤两次。
9、400μL 1×blocking buffer重悬，上机检测。

实验结果分析：

cytochrome c and smac/diablo

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2013-3-8 11:01 上传

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，下载需要1颗流星（为什么？）

EthanMr

我用这个方法做过cyt c的检测，算是能看出来差别。孵二抗的时候，我把条件改成了室温4小时，结果如下，红色为对照，蓝色为处理组。