请问做CD4+CD25+CD127LowTreg的详细操作步骤

niwanmao

标题：请问做CD4+CD25+CD127LowTreg的详细操作步骤

niwanmao老师您好!

由于购买成套的CD4+CD25+CD127LowTreg试剂盒很贵,所以单买三个抗体及相应的同型对照,其中FITC-CD4,PE-CY7CD25购自BD公司,PE-CD127购自ebioscience公司,进行三色分析,(注我们的流式细胞仪是三色的)不知这样搭配行吗?

我想做外周血的Treg,即先用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞后,再做Treg实验,可我是新手,以前没接触过流式操作,因此想问问用提取好的淋巴细胞做Treg的详细操作步骤,请niwanmao老师帮我解决下这两个问题,不胜感激!!

回答者：niwanmao

llhlz1971，您好。

1、如果你的流式机型支持这三种染料，这样的搭配是可以的。

2、淋巴细胞不需要分离，因为在分析时通过FSC-SSC两个参数，可以把淋巴细胞圈出来。当然，如果用Ficoll分也没问题。

分析步骤如下：

1. 画Dot Plot，横坐标FSC，纵坐标SSC。圈出淋巴细胞，设为R1。
2. 画Dot Plot，横坐标CD4，纵坐标FSC，将Gate设为R1，圈出CD4、CD25双阳性的细胞，设为R2。
3. 画Dot Plot，横坐标为CD25，纵坐标CD127，将Gate设为R1 AND R2，圈出CD25+CD127low细胞，即为Treg的比例。

2009年8月12日 0:54

YGao

Treg不是在CD127low的群体里吗，为什么最后Histogram直接画CD127阴性呢？

niwanmao

YGao 发表于 2019-5-27 20:40
Treg不是在CD127low的群体里吗，为什么最后Histogram直接画CD127阴性呢？

年代如此久远的帖都被翻出来了
10年前还没做过Treg分析，所以回答比较粗糙，忽略了弱表达的群体，现已更改。

gjy5386

我直接用外周血进行检测，用的是CD4PERCP/CD25PE/CD127APC，三个抗体与50ul全血孵育25min,裂红后洗涤两次，直接上样，先gate淋巴细胞，再gateCD4+细胞，最后看CD25/CD127表达，可以加个等高图，未经特殊处理的Treg分群还是比较明显，补偿也比较好调。

gjy5386

直接全血染色，裂红后洗涤两遍，未处理的全血样本Treg分群还是比较好的。

gjy5386

坟贴啊