三幅图让您认识为什么实验中要鉴别细胞死活

niwanmao

以前发过一篇帖子《流式细胞术活性染料：不仅仅是生死的问题》，讲述了流式检测时使用活性染料鉴别细胞死活的重要性，但可能对大多数FLOWER只是管中窥豹，那么如何才能令FLOWER能够更深刻地认识到使用死活鉴别染料的重要性呢？我想来想去，只有用实例。那么来吧，看一下我今天检测Treg的结果吧。

首先说明，这个外周血标本是今天新接收到的，并且收到立即处理，按照道理应该是细胞活性很好，没有必要用死活鉴别染料的，但是，我们依然习惯性加上细胞死活染料，结果如下：
1、不设门的情况下，可以看到淋巴细胞区域和单核细胞区域出现较多斜向细胞，与这两个区域重叠，并且粒细胞左侧出现一类怪细胞，这些混杂细胞均不少，并且无法通过FSC/SSC排除掉。


2、在live/dead FITC染色的散点图上，我们可以很清晰地看出前面看到的这些信号都是死细胞，FSC/SSC均呈现为放射状分布，如下图所示，很奇怪地的是，这些细胞中也有CD3+，也可以表达CD127等，如果不排除，可想而知，会对结果会有多大影响。


3、假如我们不圈这些细胞，只圈下面live/dead FITC阴性的活细胞，令人惊喜，FSC/SSC散点图清晰地呈现出十分典型而漂亮的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群，界限清楚，此时分析Treg，分群亦明显。



由此实例可见，我们不能相信标本的送检时间和标本的保存条件，很有可能中间某个环节出问题，导致细胞死亡太多，最后即使你及时处理也做不好结果。其实，很多在论坛上提问的FLOWER实验结果不佳，跟没有用活性染料鉴别死活相关，但他们没有意识到这点。

最后要强调一点的是，live/dead等试剂是商业化试剂，如果为了节省成本起见，可考虑用PI或7-AAD等染料，方法详见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4372-1-1.html

gaga1989xl

倪老师，您好！我最近也在做慢性粒细胞性白血病患者外周血中T-reg细胞检测，患者的外周血PBMC提取后进行染色流式分析，FSC和SSC图根本不能将淋巴细胞门圈出，原因是患者PBMC绝大多数是肿瘤性的幼稚粒细胞，如果全部圈取后再用CD3进行圈门，发现非常多假阳性，此次看到您的这篇帖子很受启发。那么：在进行这个实验时除了增加死活鉴定外，Fc受体的封闭是不是也应该特别重视？我用正常人的外周血直接溶血标记CD3后圈取单核细胞或粒细胞群都出现了不同程度的假阳性，并且用5%FBS进行封闭仍不能解决这个问题。如果死活鉴定跟Fc受体封闭均进行了处理，还仍然有假阳性，那我该怎么办呢？不知道临床上检测CML患者T细胞亚群是怎样进行圈门的，是再增加CD45门吗？期待您的回答。谢谢！

niwanmao

gaga1989xl 发表于 2015-10-2 10:13
倪老师，您好！我最近也在做慢性粒细胞性白血病患者外周血中T-reg细胞检测，患者的外周血PBMC提取后进行染 ...

质量好的抗体这方面影响很小，可以说Fc受体的封闭至少在Treg检测上不是一个重要的影响因素，你所说的问题应该是其它原因造成的（细胞活性或者肿瘤细胞干扰）。
建议：加上CD45，再加live/dead。

gaga1989xl

niwanmao 发表于 2015-10-2 14:41
质量好的抗体这方面影响很小，可以说Fc受体的封闭至少在Treg检测上不是一个重要的影响因素，你所说的问题 ...

是的，干扰因素比较多(细胞状态，抗体质量以及肿瘤细胞干扰)，请问下倪老师，您这个实验中live/dead染料是哪个公司的？可以选择除了FITC之外的的荧光素吗?

niwanmao

gaga1989xl 发表于 2015-10-3 00:35
是的，干扰因素比较多(细胞状态，抗体质量以及肿瘤细胞干扰)，请问下倪老师，您这个实验中live/dead染料 ...

Life的，有多种荧光素可选。其它的商业化活性染料也有，例如：eFluor可固定染料、Horizon染料、Biolegend的Zombie染料和Ghost染料。各有优势。

gaga1989xl

niwanmao 发表于 2015-10-3 10:03
Life的，有多种荧光素可选。其它的商业化活性染料也有，例如：eFluor可固定染料、Horizon染料、Biolegend ...

好的，谢谢！期待您下一篇帖子可以介绍这几种可固定染料的优势，让Flower们进一步学习！

hbezyr

niwanmao 发表于 2015-10-3 10:03
Life的，有多种荧光素可选。其它的商业化活性染料也有，例如：eFluor可固定染料、Horizon染料、Biolegend ...

倪老师，您好！
请问，用了死活染料怎么调节补偿呢？
还有，如果我用PI来做的话，怎么来把这个加到我的实验操作中？

niwanmao

hbezyr 发表于 2015-10-8 15:49
倪老师，您好！
请问，用了死活染料怎么调节补偿呢？
还有，如果我用PI来做的话，怎么来把这个加到我的实 ...

看你选择什么荧光通道的死活染料。
如果你选择PI，那么就需要避免PE染料。

@.又__欠.@

倪老师，您好，请问你这些图的实验中，Threshold的设置多少的，我看左边一条线左侧没events

niwanmao

@.又__欠.@ 发表于 2018-1-8 22:19
倪老师，您好，请问你这些图的实验中，Threshold的设置多少的，我看左边一条线左侧没events ...

FSC100多。就是那里切掉的，所以看上去一条线，只要保证淋巴细胞和微球在Threshold以上就可以了。