别抽血，吐一口痰，做一下流式试试

niwanmao

流式细胞术是个强大的诊断和科研工具，但大多用在骨髓或外周血中，有时候也用在活检组织中，不过有没有想过检测痰液标本的细胞组成呢？痰液是从气管分泌的，而气管与肺紧密连接，所以用流式检测痰液的免疫细胞组成，可反映肺、支气管等部位的炎症性免疫。
我不知道国内的FLOWER有多少人做过痰液的流式，如果有的话，欢迎跟帖分享一下。这里分享一篇2013年发表在Inhal Toxicol上的文献《Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways》，不算新，但感觉挺有意义，说明流式的研究范围并不只是周期、凋亡，研究疾病相关的免疫细胞除了用血，还可以考虑用更容易的痰液。

这篇文章提到，与血、肺泡灌洗液不同的是，痰液会包含各种粘液细胞、上皮细胞、碎片，所以导致分析比较困难。不过，肺泡灌洗液由于灌洗部位不同，可能会导致细胞组成变化较大，所以用痰液可能更能稳定地反映气管和肺部的免疫细胞组成。

文章首先整理了之前文献报道过的外周血、痰液、肺泡灌洗液各类免疫细胞比例的对比（单核/巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞、支气管上皮细胞、鳞状上皮细胞、嗜碱粒细胞），见下表：


然后，文章提出了作者自己的方案，方案分10管（见下表），前两管实际上只是做了同型对照，他们很担心细胞状态不好引起的自发荧光影响分析，所以设置了这两管。第3、7、8检测固有免疫，第4、5、6管检测获得性免疫，第6管兼顾固有和获得性，第9、10管分析淋巴细胞亚群。表中的LIN抗体用的是CD14、CD16、CD19、CD20、CD3、CD56混合而成。


分析如下图，A、B均是未设门的FSC和SSC数据，貌似作者用了两者都用了Log，不知道出于什么考虑。A图比较纯粹，没有受鳞状上皮细胞污染，B图的绿色为鳞状上皮，比例较多。C、D两图分别显示CD45/SSC、FSC/SSC上粒细胞和碎片、淋巴、巨噬等细胞的位置。E图是用PI排除掉死细胞。F图是排除掉死细胞后，再回去看D图的碎片区域，发现碎片其实并不多，原来更多的是死细胞。G图则是排除掉死细胞、碎片之后的CD45＋区域，粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞分群清楚，不过对于鳞状上皮细胞污染的话，由于鳞状上皮SSC高，不容易与巨噬细胞区分开，就需要考虑H图的设门方案，用CD206标出巨噬细胞，将其与鳞状上皮明显分开。


粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞分开来之后，就开始细分了（见下图），B图结合CD64/CD16可在粒/巨噬细胞区域分出CD16hi CD64－/dim的中性粒细胞、CD16－CD64－的嗜酸粒细胞，树突状细胞也在CD16－CD64－区域，需要结合CD14－HLA-DR＋＋＋确定。


下图是对DC细胞进一步分析其CD86、CD11c、CD1a、CD83、TLR2、TLR4、CD86等信号分子表达。G、H图显示粒细胞也存在少量CD86表达。


下图则是淋巴细胞亚群分析，包括T、B、NK等。


整体看下来，个人觉得痰液流式，气管炎、支气管炎（急性、慢性）、哮喘研究尤其适合，其它疾病也值得深入研究。

全文请访问：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3677049/
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niwanmao

微信公众号一位昵称为“旭”的站友回复：

本期中的痰液并非指的我们常规意义上认为的痰液，那个痰液里面是没啥东西的，大部分是squamous cell和巨噬细胞。医学研究上用的痰液一般是诱导痰，用专用的医学设备吸入雾化的较高浓度的生理盐水使患者用力咳出深部痰，然后痰栓的挑取也是非常有技巧的，后续的分离细胞处理也非常的繁琐。并非我们想象的吐一口谈直接去做流式染色上机就好了。

这就是真正的抛砖引玉。

wllab

痰中分离单个细胞很关键，目前有相对认可的处理方式吗？之前曾因临床要求做过几个纤维支气管镜肺泡灌洗液的淋巴细胞亚群检测，当时的做得时候总感觉细胞分离得不是特别理想。

niwanmao

wllab 发表于 2016-9-30 09:25
痰中分离单个细胞很关键，目前有相对认可的处理方式吗？之前曾因临床要求做过几个纤维支气管镜肺泡灌洗液的 ...

肺泡灌洗液不涉及到细胞分离，关键是保持细胞活力，这类标本可考虑用一下细胞保存液，能够更大程度上保证细胞活力，细胞分群也会更好：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html  。灌洗液我没应用过，但是相似的细胞也很少的脑脊液我用过：脑脊液和淋巴结应用实例（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5331-1-1.html）

至于从痰液中分离单个细胞，首先痰液必须要诱导痰，其次，处理也需要技巧，可参考上面这篇文献。

wllab

学习了，多谢倪老师！