基因魔剪—CRISPR/Cas9系统（一）

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  这一次小优专题给您带来的是什么内容呢？没错，就是当下最火的基因编辑技术—被称为基因魔剪的CRISPR/Cas9基因编辑系统。优宁维生物技术股份有限公司现在提供目标特异性的CRISPR/Cas9敲除质粒（target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids），CRISPR双切口酶质粒（CRISPR Double Nickase Plasmids），CRISPR/dCas9激活质粒（CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids）以及CRISPR Lenti Activation系统等产品，涵盖编码18910种人类蛋白质以及18340种小鼠蛋白质的基因，同时，为您提供实验中需要用到的转染试剂、细胞培养基以及抗体等产品。

  那么，什么是CRISPR/Cas9系统呢？小优先带您了解一下。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA1,2。在细菌与古细菌体内，CRISPR基因座捕获并融合噬菌体等带来的外来遗传物质形成的新的区域也被叫做间隔序列，其形成了一段序列特异性的片段用来抵抗噬菌体未来的侵染。这些序列特异性的片段，被转录成相应的短CRISPR RNA（crRNAs），发挥向导作用，指引同样由CRISPR基因座编码表达的CRISPR关联蛋白（Cas）直接剪切掉外源入侵的DNA1,2。CRISPR II型系统的Cas9核酸酶有一个RNA结合结构域，一个α螺旋识别区（REC），一个包含RuvC和HNH来进行DNA剪切的核酸酶功能区，以及一个原型间隔序列毗邻基序（PAM）作用位点1,2。crRNA通过结合到REG区域中的α螺旋桥上与Cas9核酸酶形成复合体，并且与crRNA的主体形成多重盐桥1,2,3。

  当crRNA结合到Cas9上时，Cas9构像发生改变，允许DNA结合1,2,3。Cas9/crRNA复合体通过PAM（5’-NGG）位点扫描DNA序列4,5,6。PAM位点识别成功以后，引起对应位置的DNA解旋，允许crRNA通过碱基互补配对的方式检测临近PAM位点的DNA序列。当临近PAM位点的序列与crRNA可以互补配对时，REC区域中的螺旋桥会与目标DNA形成一个RNA-DNA的杂合双链3,4,7，进而激活HNH与RuvC核酸酶结构域活化，使目标DNA双链断裂（DSB），引起DNA降解1,2,5,8。如果crRNA不能与临近PAM位点的DNA序列互补配对，Cas9复合体则与DNA脱离，继续扫描下一个PAM位点7。目标基因的DNA双链断裂，可以通过非同源末端结合（NHEJ）方式修复，通过这种方式可以插入或敲除错误序列，或者通过同源重组修复（HDR）方式修复，可以被用来在基因组的特定位点与选定的标记结合2,9,10。CRISPR/Cas9机制可以在多种系统中进行基因编辑，包括在哺乳动物细胞中。

图1. CRISPR/Cas系统作用原理示意图

  通过造成DNA双链断裂来进行基因编辑的方式还包括大范围核酸酶技术，锌指核酸酶（ZFNs）技术以及转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）技术，后两种技术也可以识别特异性的DNA序列，但是，这些技术都有他们的局限性。大范围核酸酶技术的缺点在于很难确认核酸酶是否作用与DNA序列的特异性识别位点2。而ZFNs和TALENs技术则很难设计以及无法识别3个碱基以上的DNA序列。发挥类似于crRNA作用的小向导RNA（sgRNAs）设计简单，并且可以与Cas9核酸酶共同使用一个载体表达，进而特异性的识别DNA位点进行基因编辑。CRISPR/Cas9系统在筛选中的应用相较于小发卡RNAs也有灵敏度更高和效率更高的优势。

图2. CRISPR/Cas9介导的DNA双链断裂示意图

  应用CRISPR/Cas9系统在基因组中通过DSB编辑相较于其他方式而言，一个显而易见的优势就是较高的效率。但是，影响CRISPR/Cas9的效率的最大问题就是脱靶效应，脱靶效应降低了CRISPR/Cas9系统基因编辑的特异性。增强特异性的解决方法之一是采用CRISPR双切口系统，即采用一对质粒，每个都编码一个Cas9（D10A）切口酶突变体，以及一个直接的，位点特异性的向导RNA12。每一个Cas9n/sgRNA复合体都只能切开互补配对的DNA双链的其中一条12。每一对向导RNA大概20 bp，分别识别基因组DNA的两条相对序列。由一对Cas9n/sgRNA复合体完成对DNA双链的剪切，模拟DSB12。因此，使用成对的向导RNA提供了更强的特异性，也就保持了CRISPR系统较高的效率12。

  除了基因编辑，CRISPR系统还被改造利用在增强内源性基因表达方面13。许多CRISPR系统的组件已经被改造成适应协同激活介导因子（SAM）的复合体，成为高效率的特异性转录因子激活系统。其中，一个SAM复合体中的组件是由Cas9核酸酶改造而来。在SAM系统中，Cas9的催化亚区已经被失活，并且将失去核酸酶活性的dCas9与一个转录激活亚区（VP64）融合。这样，由特异性的向导RNA（sgRNA）引导，dCas9-VP64-sgRNA复合体结合到目的基因转录起始位点（TSS）上游200 bp左右的区域，就会使目的基因的转录水平上调13。为了进一步增强转录，sgRNA经过改造，在四环以及主环2上加上了小的发卡样核酸适配体13。这个加到sgRNA上面的核酸适配体会选择性的结合到带有MS2二聚体的噬菌体外壳蛋白上13。将MS2蛋白与p65和HSF1反式转录激活结构域融合，使得MS2-P65-HSF1融合蛋白可以增强对转录因子的募集作用，这样就会增强dCas9调节的基因激活能力13。基因活化产品包括转染用的标准质粒以及慢病毒包装的转导用慢病毒质粒，可以为所有的细胞类型高效地提供SAM转录激活系统13。怎么样，经过小优的讲解，大家是不是对CRISPR/Cas9系统更加了解了呢？在接下来的小优专题CRISPR/Cas9篇中，小优将为您带来CRISPR/Cas9实验流程中优宁维可以为您提供的解决方案和优质的产品与服务，敬请期待。

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