流式分选 Hoechst33342 分析DNA倍性问题？

nkuguian

流式新手，对一些东西不太懂，希望大咖给个简单明了的解释。

实验主要是通过PI+Hoechst33342对活细胞群进行分选，PI去除死细胞，Hoechst分析DNA倍性，然后筛选出1倍体，4倍体细胞和2倍体中一个特殊群。而对于2倍体中一个特殊群细胞用hoechst进行分析时有疑问：

文章描述如下：Excitation optics: near-UV (375-nm) and blue (488-nm) lasersDetection optics: filter combination consisting of 450/40 bandpass
(Ho342-blue detection), 670 longpass (Ho342-red and PI detection), and
610 dichroic longpass mirror (beam splitter)

疑问是：（1）Hoechst 用375激发后，用450 filter 能理解（即ho342-blue），为何可以同时检测670（ho342-red），670这个在仪器设置时应该选择哪个通道？（2）PI和ho342-red 同一个通道检测？

坐等大咖！

miliamlau

1. 如果只是标记DNA倍性的话，仅检测Ho342 Blue通道（450/40）即可。文献中提到的Ho342 Red通道（670LP）是其光谱的红光部分，与Ho342 Blue组合可以检测侧群干细胞，就是你所说的那群特殊细胞。

2. 流式可以在不同激发光上使用相同波长范围的通道。例如：PE-Cy7和APC-Cy7。这一实验中，PI通道设在488nm激发光上，而ho342-red通道设在375nm激发光上，二者可以清楚区分，并不是一个通道。

jmc_1211

miliamlau 发表于 2017-12-4 22:51
1. 如果只是标记DNA倍性的话，仅检测Ho342 Blue通道（450/40）即可。文献中提到的Ho342 Red通道（670LP）是 ...

1 hoechst 的发射光谱在640几乎就没有光了，为啥要选择670附近的光做检测呢？可不可以是600附近的？
2 hoechst blue可以看DNA的倍性，那么单纯的hoechst red指标的意义是什么？

请您指导，非常感谢！