细胞之间的深情相拥

niwanmao

问题
一位站友问，是否能鉴别由于Cell-in-Cell作用被肿瘤细胞吞噬的淋巴细胞亚群？

背景和资料
广东的Meifang He等人在2015年的Sci Rep上发的文章，里面介绍的背景和检测方法挺好，特编译分享：
数十年来，病理学家在各种人类肿瘤样本中看到了一种特殊结构，就是形态正常的细胞被其它细胞包裹着。 曾经有一些术语，如“细胞自相残杀”和“细胞吞噬作用”等被用来描述这些独特的结构，直到2008年开始才被赋予统一的名称“cell-in-cell”结构（CICs）。

根据参与结构形成的细胞种类不同，CIC可大致分为两类：
1）同型CIC，结构由相同类型的细胞形成，如上皮细胞；
2）异型CIC，结构由不同类型的细胞形成，例如由上皮细胞和淋巴细胞共同形成。

对CIC的研究成为近年来的研究热点，很大程度上是由于形成CIC会导致大部分内化细胞死亡，其中entosis可能是同型CIC细胞死亡机制。 最近的研究表明，CICs的形成在免疫稳态和肿瘤发生中起着重要作用，可能是进化上保守的现象。 从机制上看，CICs的形成可能反映了相遇的细胞之间的竞争性，代表了细胞竞争的新机制。

对CIC日益增高的研究需求，需要有更可靠的方法来辅助。研究entosis的方法中，同型CIC大多通过显微镜观察手动定量。虽然同型或异型CIC均可通过显微镜观察定量，但这种方法对于多个样品来说相对主观且费力、费时。流式细胞术是一种理想的高通量方法，可快速定量分析CIC。

在实验中，作者采用了PLC/PRF/5、MCF7、SK-BR-3、RD、Molt-4、Raji、BxPC3、NK92MI等细胞株。肿瘤细胞事先用2.5uM CellTracker Green CMFDA于37度无血清孵育标记30分钟，然后以含10％ FBS的DMEM培养基在6孔板37度培养12小时使其贴壁，初始细胞量3.5×10E5/孔。
免疫细胞则用10ul CD45 PE室温标记20分钟，然后与肿瘤细胞共培养(也是每孔3.5×10E5细胞)。
孵育一定时间后，去除培养基，倒掉脱落的细胞，用D-PBS洗涤，接着用0.25% trypsin/EDTA(每孔300ul，37度)消化，直至贴壁细胞解离，加入等体积的含20％ FBS的HBSS液终止反应。接着通过150×g离心5 分钟，以400ul 含20％ FBS的HBSS液重悬，过滤、上机。

这里，文章中着重探讨了避免粘连细胞对CIC信号影响的最佳条件，发现20％ FBS是比较好的。

结果图形如下：


鉴别被吞噬细胞类型
如前面那位站友所问，他们采用CD3 PE标记被吞噬的淋巴细胞，然后用流式分选，很多次均成功分选出CIC细胞，但他们希望进一步知道究竟被吞的是哪类淋巴细胞。
我的建议是增加标记，例如标记CD3、CD4、CD8等多个抗体标记淋巴细胞，再去让肿瘤细胞吞噬，看CD45－细胞群体中CD3＋亚群中，CD4、CD8的表达。而站友担心的是标记这么多抗体，是否会影响吞噬？
此外，我还在想，如果按照他们之前的步骤分选出CIC细胞之后，再通过固定、破膜，标记细胞内被吞噬淋巴细胞的CD4、CD8，是否也可以？

这两个方法，如果你有CIC方面的经验，欢迎留言讨论一下这两个方案的可行性，或者你是否有更好的方法？


参考文献：
Overholtzer, M. & Brugge, J. S. The cell biology of cell-in-cell structures. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 796–809, 10.1038/nrm2504 (2008).
He M, Huang H, Wang M, et al. Fluorescence-Activated Cell Sorting Analysis of Heterotypic Cell-in-Cell Structures. Sci Rep. 2015 Apr 27;5:9588. doi: 10.1038/srep09588.