阳性细胞整体漂移

称子丫头

大家好，麻烦请教一下，为什么我的双标会出现整体细胞偏移？这样的结果，能算作阳性吗？

1.用CyteFlex做的流式分析。

2.间接标记法。一抗为自己实验室制备的多克隆抗体（特殊目标物种，没有市受抗体），WB检测特异性较好。二抗分别为FITC和APC标记（分别为兔源和鼠源）。用山羊血清4℃封闭FcR1h，标记反应全部在4℃进行。

3.分析方法。先圈出淋巴细胞门，再圈门去除细胞黏连，PI染色去除死细胞（FITC和PI通道调过补偿）。根据阴性对照画十字象限。

①  阴性对照不加一抗，只加两种二抗

②  双标结果（不用调补偿，所以没有设置单标管）

③ 单纯的裸细胞，不进行任何标记（主要是想看看二抗对细胞标记的影响）

niwanmao

1、山羊血清封闭效果如何，是否经过验证？在哪一步封闭？为什么不用比较常用的BSA？
2、不建议用空白对照设门。你的设门对照，我觉得可以考虑：一抗用你们制备的多克隆抗体、二抗用对应的带荧光的同型对照，虽然同型对照的概念有点过时，但对于间标并且分群不明显的时候，也可以用。

称子丫头

1. 山羊血清先封闭，再加一抗二抗。怎么验证封闭效果呢？因为我觉得山羊血清相对于牛血清白蛋白，可能对FcR有更广泛的封闭作用，不知道是否正确？
2. 请问老师，我的设门对照可以这样做吗：用正常鼠/兔的血清作为同型对照一抗，二抗和实验组一样？

称子丫头

niwanmao 发表于 2018-11-25 18:47
1、山羊血清封闭效果如何，是否经过验证？在哪一步封闭？为什么不用比较常用的BSA？
2、不建议用空白对照设 ...

1. 山羊血清先封闭，再加一抗二抗。怎么验证封闭效果呢？因为我觉得山羊血清相对于牛血清白蛋白，可能对FcR有更广泛的封闭作用，不知道是否正确？
2. 请问老师，我的设门对照可以这样做吗：用正常鼠/兔的血清作为同型对照一抗，二抗和实验组一样？