贴壁细胞膜蛋白流式检测处理过程

marvelwong

请问对于正常培养的贴壁内皮细胞膜蛋白检测流式检测处理过程是怎样的？做了好几次都没有染色成功。不是直标抗体，要一抗二抗分开染色。

1.贴壁细胞去除培养液，加入PBS洗一次，参考文献使用 Cellstripper™ buffer这种非酶消化液消化细胞，吹下细胞，使用PBS洗两次；
2.细胞使用流式染色buffer重悬，加入一定质量的一抗，冰上孵育1小时；
3.流式buffer洗两次，加入buffer重悬，加入488荧光二抗，避光冰上孵育1小时；
4.加入细胞固定液，上机检测。


请问这个染色过程有问题吗？还需要怎么改进？是否需要添加FcR blocking步骤？谢谢。

niwanmao

不加固定液直接检测呢？
由于不了解你检测的指标以及细胞性质，也没有图形，所以很难判断问题在哪里。

marvelwong

niwanmao 发表于 2019-2-27 21:01
不加固定液直接检测呢？
由于不了解你检测的指标以及细胞性质，也没有图形，所以很难判断问题在哪里。 ...

倪老师，您好。
就是我是检测内皮细胞CD309的表达。这个是做阳性对照，理论上内皮细胞应该接近100%的细胞都会表达CD309，我的实验操作步骤是上面描述的那样，为了防止胰酶消化破坏膜蛋白结构，用了文献报道的那种细胞消化液。接着一抗二抗分开染色的。
请问固定会对普通荧光二抗有影响吗？还是说得染色完就必须上机检测？想问一下是哪些步骤出了问题？谢谢。

Mr.night

我可以请教一个问题吗？就是既然是胰酶会影响的话，可以直接用细胞刮刮下来吗？与非酶消化液的区别是（感觉既然是消化这种过程，是不是会对表面marker有影响）？

niwanmao

marvelwong 发表于 2019-2-28 10:11
倪老师，您好。
就是我是检测内皮细胞CD309的表达。这个是做阳性对照，理论上内皮细胞应该接近100%的细胞 ...

胰酶确实会影响某些CD分子，但是是否会影响CD309我倒是没注意。
从图上看，细胞群还是不错的，那么后续的问题就是要排除一下究竟是否抗体原因，仔细看一下一抗和二抗是否都是匹配的？这两个抗体是否适合流式？

marvelwong

Mr.night 发表于 2019-2-28 16:30
我可以请教一个问题吗？就是既然是胰酶会影响的话，可以直接用细胞刮刮下来吗？与非酶消化液的区别是（感觉 ...

文献是使用使用这种消化液消化贴壁细胞进行流式检测，我觉得直接刮下来细胞容易粘连，并且死细胞可能会增多。纯属个人意见。