求老师支招：裂解细胞核做流式，加入70%乙醇固定黏连怎...

liuyongqiang

各位老师和大神好：
     本人是流式小白，最近做到四膜虫（大小20-40μm）细胞核（大核直径10μm）的流式主要是用来看某一个时期的细胞占比，由于是通过加入裂解液后冰浴低渗法直接裂出细胞核，里面包含了裂解后的细胞碎片和黏糊状蛋白，加入甲醇或者70乙醇固定后，通过在荧光显微镜上观察，细胞黏连很严重，直接上机做了很久没有拿到好的结果。如果不加乙醇，细胞核直接用RNAnase A 和PI染色，细胞黏连没有那么严重，显微镜下观察也能染上颜色。但是后期，我实验必须要攒着样品，一起上样，不能制备一个上一个。所以请问大家，1. 有什么好的办法能够对裂核的细胞去除杂质蛋白和碎片？
2. 喷嘴100μm的能否直接细胞不裂核上机？
3.如果不加乙醇固定，细胞核在PBS中放4度过夜后能再去上流式吗？会不会有信号的降低影响实验结果？求大神给点指导意见和解决的办法。

下面是我的上机实验protocol(Fig.2)，和我用BD Arill III做的结果(FIG. 3)，以及人家做的好的结果的对照(Fig.1)。请大神指导，我还有哪里能够优化的吗？。

niwanmao

直接细胞染的话，可能就是死细胞了。

提取细胞核的话，给你推荐一个配方：

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liuyongqiang

niwanmao 发表于 2019-4-28 16:56
直接细胞染的话，可能就是死细胞了。

提取细胞核的话，给你推荐一个配方：

好的，谢谢老师。刷了一天了，终于等到您的回复。我可以试试。

liuyongqiang

niwanmao 发表于 2019-4-28 16:56
直接细胞染的话，可能就是死细胞了。

提取细胞核的话，给你推荐一个配方：

老师，您好。最近，也根据您的步骤上了一次机。调整了FLow的实验方案，由于我的细胞倍数是45倍体，倍性较大因此横纵坐标改为了log。结果见我穿的新图。还是和国外的结果还是有些差异。说明一下不同之处：美国的flow结果图可能对四膜虫细胞同步化在G1期后进行的Flow的结果。我的没有进行同步化，是一个混合体。我的问题是：我flow结果的SSC-A通道的虫子为什么和国外的结果（见第一次发帖图）不一致？我的PI-A通道圈的门下面为什么感觉还是有一团细胞？也是核吗？（四膜虫有大核和小核，可能是小核团？，还是不同时期的大核团？）我感觉您给的步骤会稍好些，但是细胞核还是黏连比较严重，您有去黏连什么更好的建议吗？谢谢老师。老师，刚才刷帖子，看到你对加乙醇的建议是，在残留的细胞核中，直接加上70%的乙醇，而我做的一般是滴加的无水乙醇至终浓度70%，可能核黏连的程度会更大些吗？

liuyongqiang

                               
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