困扰了3个月的细胞周期问题

plity

各位老师好~来到流式中文网有段时间了，学习了很多有用的东西，从刚接触流式到现在确实收获颇丰~

先说说我自己的实验情况：
目的：通过TPO诱导分化DAMI（人巨核细胞白血病细胞），再分析分化好的CD41+的倍体情况（方法和细胞周期类似）。
理想的结果图（别人文献里面的）应该是这样的（下图D）
目前遇到的问题和现阶段采用的应对方法：
问题1：我需要从总体中先标记CD41表面Marker，而经查阅资料和反复尝试发现，无论是先标记marker再固定还是先固定再标记对结果的影响都很大，标记后固定对APC，PE等应该影响很大，而且未标记的也会出现阳性信号（假阳性）。对于这种需要从总体里面标记部分细胞做DNA染色的实验，各位老师是否有经验传授。

尝试解决方法1：经查阅大量资料，先改用HOECHST 33342代替PI染色，该活细胞染料无需固定，所以可以同时进行CD41和DNA染色，目前得到了比较满意的CD41阳性信号，但仍有新的问题，就是HOECHST 33342信号峰值不明显，图如下：


疑问1：我得到这样的峰值是不是和收样速度有关，我收取细胞的速度较快，因为细胞浓度较大
疑问2：会不会有染色不充分的问题，因为理论上说DNA含量在2n,4n,8n较多，而其它含量应该较少（比如S期），但我这个结果提示其它含量的细胞也很多，即出现峰值不明显的情况。我用的hoechst的染色终浓度为10ug/mL.
疑问3：关于电压，DNA染料的增益合适范围是多少，比如2n（G1峰）位置多少合适呢。

针对以上问题，各位老师有什么导，还望不吝赐教~

niwanmao

整理了下你的帖子，但发现仍少几个图，目前你传上来的图，是HO33342的染色结果？

如果是的话，感觉应该是染色步骤问题。

Hoechst 33342 的 DNA 染色方案如下：
1、在 37°C 下用 Hoechst 33342孵育细胞 10-60 分钟。 使用的 Hoechst 浓度必须预先优化，因为不同细胞的最佳浓度会有所不同，一般在 5-20µg/ml 的范围内。
2、孵育完毕，以 1000 转/分的速度离心5分钟。 在 PBS 中洗涤2次。 必要时，可加入低浓度的PI孵育1分钟排除死细胞。
3、上机，收集 390nm 和 480nm 之间发射的 Hoechst 荧光。