|
|
悬赏1流星未解决
实验步骤：
步骤1、取小鼠脾脏,100um滤网,注射器内芯研磨,PBS液(含2%FBS+2mM EDTA）冲洗研磨碎屑至50ml离心管,离心350g,5min,弃上清。
步骤2、加入1x红细胞裂解液裂解3ml(每脾脏/3ml,1x红细胞裂解液,用DI水稀释),裂解5min后(冰上),加入等体积PBS液(含2%FBS+2mM EDTA),离心350g,5min,弃上清。若上清液“显红色”，可重复一遍。
步骤3、3ml 1640(含10%FBS+1%P.S)重悬至中号培养皿,加入 PMA（终浓度50ng/ml）,Ionomycin（终浓度1ug/ml）,BFA（5ug/ml）（PMA、Ionomycin、BFA均从碧云天购买）37℃孵箱孵育4小时后,离心350g,5min,弃上清,加入PBS液(含2%FBS+2mM EDTA)吹打,离心同前,弃上清。
步骤4、 PBS液(含2%FBS+2mM EDTA)重悬,计数,母液细胞浓度1-2x10^7cells/ml,吸100ul至流式管,即1-2x10^6cells/tube.
步骤5、共8管：
- Th1，CD4+IFN
- Th2，CD4+IL4
- Th17，CD4+IL17A
- 空白对照
- CD4单阳
- IFN单阳
- IL17单阳
- IL4单阳
步骤6、CD4抗体1ul,避光,4°孵育30min。
步骤7、加入PBS液(含2%FBS+2mM EDTA)吹打,离心350g,5min,弃上清。1遍。
步骤8、eBioscience 的Fixation/Permeabilization concentrate：Fixation/Permeabilization Diluent=1:3混合，1ml/tube，避光4°30min。（这个是Foxp3 kit，但实验室的人和试剂公司的技术都说可以用来破细胞膜）
步骤9、不离心，直接加入Permeabilization Buffer 1x，震荡，离心350g,5min,弃上清。
步骤10、100ul Permeabilization Buffer重悬，每管加入对应抗体(抗体均为biolegend)，避光，室温，60min：
- IFN _2ul
- IL4 _5ul
- IL17 _1ul
- 空
- 空
- IFN _2ul
- IL17 _1ul
- IL4 _5ul
步骤11、每管加2ml Permeabilization Buffer震荡，离心350g,5min,弃上清。
步骤12、300ul 1%多聚甲醛重悬，上机。
以上为我目前的实验步骤，重复过3遍，但每次Th1/17，只有2.x%，Th2，只有1%左右。
问题：
1，请问有可能是哪一步或哪几布除了问题？
2，正常小鼠脾脏Th1/2/17/Treg比例应该是多少？
3，Sigma的PMA、Ionomycin、BFA官网显示无库存无报价，咨询后邮件回复现在无法进入国内了。那么有没有哪个厂家的可以替代，效果比较好？
谢谢！
|
|
发表于 2016-6-20 22:28:02
发表于 2016-6-21 20:24:05
