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[凋亡检测] ROS和线粒体膜电位圈门问题

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发表于 2014-4-18 14:00:58 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
药物诱导细胞凋亡,利用AnnexinV和PI检测凋亡,再用JC-1检测线粒体膜电位,DFCH检测ROS,问题是在流式检测凋亡、线粒体膜电位和ROS时,FSC/SSC是圈非碎片的所有细胞还是只圈状态好的活细胞(P4 or P5)?

P4 or P5

P4 or P5
发表于 2014-4-18 20:51:41 | 显示全部楼层
ROS和线粒体膜电位属于早期事件,所以这时的细胞形态应该是没有明显变化的,所以建议采用P4。
发表于 2014-4-19 08:44:55 | 显示全部楼层
这些实验我都做过,个人认为只圈P4即可。因为不管是JC-1测膜电位还是DCFH测ROS,都是针对完整细胞形态的正常细胞内的事件进行分析的,所以直接圈正常细胞即可。
 楼主| 发表于 2014-4-19 09:32:09 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-4-18 20:51
ROS和线粒体膜电位属于早期事件,所以这时的细胞形态应该是没有明显变化的,所以建议采用P4。 ...

谢谢老师!那么在用AnnexinV和PI测凋亡时,FSC/SSC圈门是应该圈出各种状态的细胞吧(P5门)?圈门后在FITC/PI图中,标记FITC+PI-的早调细胞群,在FSC/SSC图中大部分却是在靠近SSC的细胞群中,是说明早调细胞的形态就有改变了么?还是样本自身死细胞较多造成的?
 楼主| 发表于 2014-4-19 10:05:09 | 显示全部楼层
cccssszzz08 发表于 2014-4-19 08:44
这些实验我都做过,个人认为只圈P4即可。因为不管是JC-1测膜电位还是DCFH测ROS,都是针对完整细胞形态的正 ...

谢谢!圈P4门后,JC-1测得结果貌似和看到的标准图差别比较大呀,调节补偿也不能正常,帮忙看下这个正常么?
JC-1.PNG
发表于 2014-4-19 18:55:42 | 显示全部楼层
格利雅 发表于 2014-4-19 09:32
谢谢老师!那么在用AnnexinV和PI测凋亡时,FSC/SSC圈门是应该圈出各种状态的细胞吧(P5门)?圈门后在FIT ...

部分介于早期凋亡和晚期凋亡之间,或者早期凋亡较晚阶段的细胞,会发生FSC改变。所以AV/PI时是需要圈P5。
发表于 2014-4-19 18:57:46 | 显示全部楼层
格利雅 发表于 2014-4-19 10:05
谢谢!圈P4门后,JC-1测得结果貌似和看到的标准图差别比较大呀,调节补偿也不能正常,帮忙看下这个正常么 ...

我觉得,象P4门内那样FL1增高、FL2降低更能反映以下原理:
正常细胞的线粒体膜电位电压较高,可形成JC-1的聚集体,发出红色荧光,而线粒体膜电位降低的细胞,则会形成JC-1单体,发出绿色荧光。
发表于 2014-4-20 20:53:54 | 显示全部楼层
格利雅 发表于 2014-4-19 10:05
谢谢!圈P4门后,JC-1测得结果貌似和看到的标准图差别比较大呀,调节补偿也不能正常,帮忙看下这个正常么 ...

确实很奇怪,感觉你圈左边的那个团出的JC-1结果较为正常。我原来做膜电位是用RH123做的,JC-1只是见文献上的图了,和你底下的那排比较接近。但是这个图能反应你想要的结果吗?
 楼主| 发表于 2014-4-20 21:44:02 | 显示全部楼层
cccssszzz08 发表于 2014-4-20 20:53
确实很奇怪,感觉你圈左边的那个团出的JC-1结果较为正常。我原来做膜电位是用RH123做的,JC-1只是见文献 ...

圈左边那群细胞也是随着加药浓度升高,JC-1图中细胞群整体逐渐下移;而圈右边正常细胞群,JC-1图中,我想是不是就是分别圈出左上和右下两群细胞,左上认为是FL2阳性线粒体膜电位高的细胞群,右下认为是FL1阳性线粒体膜电位低的细胞群,比较右下细胞群的比例变化。各位老师觉得这样合理么?@niwanmao @cccssszzz08
发表于 2014-4-21 08:52:44 | 显示全部楼层

没错,就是这样分析来自: Android客户端
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