Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒

infouniv

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒

一、概述

      在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。
AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

   因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

                               
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二、试剂盒组份          

产品编号	产品名称	规格
556547	Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I	100tests
Components
556547a	Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E)
556547b	Annexin V-FITC (51-65874X)
556547c	Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)

三、实验步骤
        贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2％的BSA可防止消化过度。如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。
（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；
（2）细胞收集。悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；
（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；
（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；
（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；
（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。
（7）上机前，补加200μL的1×Binding Buffer。

四、保存：
4℃保存；避免反复冻融。

五、注意事项
（1）本试剂只适用于实验，不适用于临床检测；
（2）PI（propidium iodide，碘化丙锭）有毒性，能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用，使用时需戴手套；
（3）Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察；
（4）整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作，以免影响细胞状态。
（5）在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。
（6）为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。
（7）PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。、

其他Annexin V系列产品清单：

产品编号	产品名称	规格
556547	ANXN V FITC APOPTOSIS DTEC KIT I	100tests
559763	ANXN V PE APOPTOSIS DTEC KIT I	100tests
556420	ANNEXIN V RECOM FITC	100tests
556422	ANNEXIN V RECOM PE	100tests
556419	ANNEXIN V RECOM FITC	200tests
556421	ANNEXIN V RECOM PE	200tests
550911	ANXN V-FITC FLUORESCENCE MICROSCOPY KIT	25tests
556463	Propidium Iodide Staining Solution	2ml
559925	7-AAD Staining Solution	2ml

niwanmao

这部分内容论坛内以前已发过，技术交流，120％的欢迎，但是建议您：技术交流内容中不要附上商业化的东西。谢谢配合！

葡萄粒

是不是需要单染AV和Pi呢，这个需要提示一下

infouniv

niwanmao 发表于 2014-4-21 19:01
这部分内容论坛内以前已发过，技术交流，120％的欢迎，但是建议您：技术交流内容中不要附上商业化的东西。 ...

好的，我会注意的，谢谢提醒。。

huoguang980789

到处都能看到这个公司的身影呀

infouniv

huoguang980789 发表于 2014-4-26 11:05
到处都能看到这个公司的身影呀

谢谢，您对我们的关注，我们做的不好的地方，希望提出宝贵的建议。再次感谢

Veblen

我在这里问一个比较初级的问题，我们做凋亡要用Pi染色，做周期也用Pi染色；我看很多我们分享的Protocol上，都是说加几ul Pi；
但是我想知道我们对于染细胞凋亡、细胞周期以及细胞死活，Pi的浓度分别是多少呢？

niwanmao

Veblen 发表于 2019-1-30 22:30
我在这里问一个比较初级的问题，我们做凋亡要用Pi染色，做周期也用Pi染色；我看很多我们分享的Protocol上， ...

测凋亡和死活的PI浓度差不多，因为都是为了区分细胞死活，终浓度2～5ug/ml
细胞周期PI终浓度要高，一般终浓度在20ug/ml左右。

Veblen

niwanmao 发表于 2019-1-31 14:18
测凋亡和死活的PI浓度差不多，因为都是为了区分细胞死活，终浓度2～5ug/ml
细胞周期PI终浓度要高，一般终 ...

好的，谢谢倪老师。
顺便问一句通过细胞周期图看细胞增殖的快慢，我的理解一般是通过S期去看，如果S期比例越大，说明细胞增殖的速度越快；
文献上提到的增殖指数指的是什么，用得多吗？

niwanmao

Veblen 发表于 2019-1-31 22:42
好的，谢谢倪老师。
顺便问一句通过细胞周期图看细胞增殖的快慢，我的理解一般是通过S期去看，如果S期比例 ...

需要看文献，我们平时看的最多是的Ki67这个核增殖抗原的表达率。