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[标本处理] JC-1检测线粒体膜电位

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发表于 2014-6-12 11:48:29 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
大虾们:
        小虾米求救,我最近要检测线粒体膜电位,用的是cayman的盒子,染色说明如下:
         我做的是人骨肉瘤细胞,是个贴壁细胞,它说前一天接种细胞,第二天染色,37℃孵育15-30min,收获细胞上机检测,我不知道如何收获细胞,需要消化吗?还是刮下来?如果消化会对前面的染色有影响吗?
          希望大家帮帮我!

jc-1.png

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也没有谁会同时调的。打开SetupMode,你可以用QuickSet调完电压以后直接点QuickComp调补偿,一管就可以做完,也不用上两次。调补偿的时候用处理组的就好了。 另外用FC500的话使用1、3通道来做JC-1会更好,第三通道是610,补偿更好调。
发表于 2014-6-12 11:48:30 | 显示全部楼层
周利 发表于 2014-6-20 11:13
补偿没有调,我用的机器是贝克曼的FC500,它在调的时候,电压和补偿只能选一个,不能同时调,我上了 ...

也没有谁会同时调的。打开SetupMode,你可以用QuickSet调完电压以后直接点QuickComp调补偿,一管就可以做完,也不用上两次。调补偿的时候用处理组的就好了。
另外用FC500的话使用1、3通道来做JC-1会更好,第三通道是610,补偿更好调。

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niwanmao + 1 感谢解答

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发表于 2014-6-12 20:00:48 | 显示全部楼层
对于自配试剂的,JC-1一般用DMSO配成1000x储存液(5 mg/ml)。
如果是标记贴壁细胞,需先将JC-1储存液用培养基稀释至5 µg/ml的工作液(稀释时注意边稀释边振荡,以防止沉淀形成),然后再将加了JC-1的培养基加到贴壁细胞中,37℃孵育10分钟或室温15分钟,最后用PBS洗涤两次、胰蛋白酶消化,500 µl PBS重悬,上机分析。

同时给做悬浮细胞的站友提个方案,如果是悬浮细胞,可将悬浮细胞与用培养基稀释至10 µg/ml 的JC-1溶液以1:1混合,最终浓度5 µg/ml,同样37℃孵育10分钟或室温15分钟,最后用PBS洗涤两次,500 µl PBS重悬,上机分析

相关链接:http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/JC1staining.htm
 楼主| 发表于 2014-6-13 09:03:12 | 显示全部楼层
老师,我还想问问,1.我的盒子JC-1是液体的,说明书上有说JC-1的稀释方法,用相应的细胞培养液1:10稀释,盒子里也有Assay Buffer ,我想清洗细胞的时候是不是用这个就可以了?
2. 我是第一次做这个实验,我的盒子里没有做阳性处理的药物,我能不能用5氟尿嘧啶诱导一下,作为阳性对照?
发表于 2014-6-13 13:09:33 | 显示全部楼层
周利 发表于 2014-6-13 09:03
老师,我还想问问,1.我的盒子JC-1是液体的,说明书上有说JC-1的稀释方法,用相应的细胞培养液1:10稀释, ...

1、如果成分跟pbs差不多,也可以用。
2、可以试试。:)
 楼主| 发表于 2014-6-18 14:04:55 | 显示全部楼层
老师,我今天做了一下线粒体膜电位检测,做了2管,一管是正常的细胞,一管是加了NaF 诱导的细胞,同时用JC-1染色,结果如下,两管没有什么变化,您看我的结果合适吗?

正常细胞

正常细胞

NaF处理

NaF处理
发表于 2014-6-18 20:32:02 | 显示全部楼层
周利 发表于 2014-6-18 14:04
老师,我今天做了一下线粒体膜电位检测,做了2管,一管是正常的细胞,一管是加了NaF 诱导的细胞,同时用JC- ...

NaF能够肯定诱导线粒体膜电位降低吗?似乎CCCP用的多吧。

从这两张图看,两者没有区分。
发表于 2014-6-19 18:26:10 | 显示全部楼层
补偿没调吧。
 楼主| 发表于 2014-6-20 11:13:45 | 显示全部楼层
       补偿没有调,我用的机器是贝克曼的FC500,它在调的时候,电压和补偿只能选一个,不能同时调,我上了两管,一管未处理细胞,一管加了NaF的细胞,我用第一管把细胞调到了对角线上,直接上了第二关,问题有两个,一是图不好看,不是椭圆型的一坨,二是两管没有差别,CCCP我已经订购了,希望拿它处理后会有阳性结果。
 楼主| 发表于 2014-6-21 14:36:48 | 显示全部楼层
今天又做了一下线粒体膜电位检测,有了好的结果,之前的图是没有调补偿惹的祸,谢谢大家的帮助!
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