流式样本制备时，是否需要添加FBS

lypzy1221

倪老师：      您好！我想请教您，在制备流式样本的时候，需要需要加1%的FBS吗？如果加了的话会对结果产生什么样的影响？
      
      我们具体情况是这样的：我们体外培养人的外周血单个核细胞，培养过程中，我们会取样做流式检测。取样后我们先用PBS（我们条件艰苦，PBS是自己购买的袋装粉剂配制的）洗涤2遍，1200r 5min，然后直接用PBS悬到1×106/100ul，加抗体4度孵育30min，PBS洗涤2遍后，用PBS重悬至1ml上机。


1、上机后发现有一群细胞（图上P2）不是我们的目标细胞，请问这是什么细胞群呢？还是说是坏死的细胞（7AAD显示活率只有10-20%）？


2、后来我又试了一下，在制备样本的过程中，全部用含1% FBS的PBS，P2细胞群会少很多，但是请问用FBS可行吗？

niwanmao

1、P2门内是活力差的细胞。
2、FBS可以减少非特异性染色，对某些脆弱的细胞可能会有一定保护作用，但很有限。

lypzy1221

niwanmao 发表于 2015-4-7 11:05
1、P2门内是活力差的细胞。
2、FBS可以减少非特异性染色，对某些脆弱的细胞可能会有一定保护作用，但很有限 ...

那我们分析的时候要不要框选P2门内的细胞呢？
我试过几次，发现如果选了的话结果图就没那么好看，好像有非特异性染色
也就是说检测人的细胞时FBS加进去不会对染色造成不好的影响？

niwanmao

lypzy1221 发表于 2015-4-7 11:12
那我们分析的时候要不要框选P2门内的细胞呢？
我试过几次，发现如果选了的话结果图就没那么好看，好像有非 ...

尽量别选P2的。
加FBS进去是好事：）

小憨

加FBS有三个好处：
1. 抗体在无任何蛋白质的缓冲体系中会吸附在离心管的管壁里，造成染色时抗体浓度不够，所以你看大部分液体的流式抗体说明书里都提到含BSA（也就是FBS中的主要成分）。
2. FBS或者BSA都可以起到封闭非特异性附的作用，减少非特异性染色。
3. 你的细胞用抗体标记的过程直到上机检测都还是活的对不对？如果把活细胞培养基中的血清撤掉细胞当然容易死了，所以才回造成P2门里那些状态不好的细胞的比例增加。

qq969385787

流式要加BSA？请问老师，怎么做流式分选是标准的步骤？？

niwanmao

qq969385787 发表于 2015-6-24 12:59
流式要加BSA？请问老师，怎么做流式分选是标准的步骤？？

分选的标准步骤最详细的需参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2295-1-1.html

命运线

niwanmao 发表于 2015-4-7 11:46
尽量别选P2的。
加FBS进去是好事：）

老师您好，请问你说的加FBS是在什么时候加的？我的混合消化酶的（胶原酶，透明质酸酶，DNase I）工作液之前用HBSS配的，消化效果不好，需不需要加1%的BSA或者FBS，但是又怕他中和消化酶

niwanmao

命运线 发表于 2018-12-27 16:57
老师您好，请问你说的加FBS是在什么时候加的？我的混合消化酶的（胶原酶，透明质酸酶，DNase I）工作液之 ...

消化液不需要用FBS，FBS是用于洗涤的，可减少非特异性结合。