大鼠th1/th2/th17/treg比例的检测

giamay

最近要做大鼠的外周血的th1/th2/th17/treg比例的检测，参考了老师的意见，将大鼠分管如下：      
1. 空白管；
2.CD4+-FITC/CD 25+-APC/Foxp3-PE；
3.CD 4+-FITC/IL4-PE/IL 17A-pecy7 /IFn- γ-ALEXA 647；
4.所对应抗体的同型对照管（共有五个，共一管）。


问题，在看了倪老师的关于FMO的解释，可不可以把同型对照去掉，然后设置FMO对照，设计如下：
前三管同上，
第四管.Foxp3的FMO，CD4+-FITC/Foxp3-PE 。
第五管.Foxp3的FMO,CD 25+-APC/Foxp3-PE。
第六管，IL的FMO ，IL4-PE/IL 17A-pecy7 /IFn- γ-ALEXA 647。
不知道我理解的FMO正确否。




2.关于破膜固定，我打算定EB的Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set Kit，但是上面标准了Foxp3专用，IL的破膜固定可不可以也有这个盒子？


3.关于刺激阻断我定的EB的Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)，因为只有IL才会刺激，所以还好。


4.没有设置补偿管


不知道我的FMO设置的是否正确？还有固定破膜盒子，是否可以在几管之间通用，还是需要另外订其他的试剂？

小憨

建议加入CD3 PerCP/Cy5.5。
我之前用BD 的Foxp3 kit，没有专门订胞内的kit，也是可以获得很好的效果的，但eB的没用过。
建议对特别重要擦参数做FMO对照。
用于调补偿的单阳管可用补偿微球，分群好，阳性率高。

小憨

刺激我用PMA和离子霉素，效果很好

giamay

小憨 发表于 2015-4-13 00:34
建议加入CD3 PerCP/Cy5.5。
我之前用BD 的Foxp3 kit，没有专门订胞内的kit，也是可以获得很好的效果的，但e ...

出了foxp3，其他破膜和固定都用的BD的Foxp3 kit吗，补偿微球是一定要的吗

niwanmao

foxP3不设FMO问题不大，因为分群都比较清楚，除了CD25稍差。

一般FMO特别适合组合内只有一个检测指标，其它都是设门抗体并且分群比较好的情况。象你这里的第6管，三个检测指标，只有一个设门指标，并且三个检测指标都是少量表达的，可能做FMO很麻烦，真要设FMO，设计如下：
1. CD4、IL4、IL17A（针对IFN-γ分析的FMO）
2. CD4、IL4、IFN-γ（针对IL17A分析的FMO）
3. CD4、IL17A、IFN-γ（针对IL4分析的FMO）
至于补偿微球，还是需要做的。

小憨

giamay 发表于 2015-4-13 07:37
出了foxp3，其他破膜和固定都用的BD的Foxp3 kit吗，补偿微球是一定要的吗

Foxp3有foxp3自己的kit，胞内细胞因子有胞内细胞因子的kit，理论上不能通用，因为一个是在细胞核，一个是在细胞质，细胞核的破膜力度肯定大于胞内，否则抗体进不去细胞核。但是我自己的经验，foxp3的破膜kit用于做胞内细胞因子的破膜也是可以的，效果挺好，但我用的是BD公司的，eB公司的我没有试过，但我个人觉得问题不大，你可以尝试一下。

giamay

小憨 发表于 2015-4-13 09:19
Foxp3有foxp3自己的kit，胞内细胞因子有胞内细胞因子的kit，理论上不能通用，因为一个是在细胞核，一个是 ...

好的，谢谢，所有抗体试剂已定

giamay

niwanmao 发表于 2015-4-13 08:29
foxP3不设FMO问题不大，因为分群都比较清楚，除了CD25稍差。

一般FMO特别适合组合内只有一个检测指标，其 ...

谢谢倪老师的解答

mylive

为什么选择CD4呢，pma刺激后不会CD4的表达会下调吧，我们平时做都选择CD3  及CD8来圈门。

niwanmao

mylive 发表于 2015-4-14 09:39
为什么选择CD4呢，pma刺激后不会CD4的表达会下调吧，我们平时做都选择CD3  及CD8来圈门。 ...

确实，@mylive 说到关键了。 @giamay  用CD3和CD8可能更好。