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[流式protocol] CFSE检测细胞增殖详细protocol

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发表于 2015-7-28 20:46:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

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由于免疫细胞在个体发育和免疫反应中会发生扩散和分化,因此在免疫现象研究中对研究细胞群体的分裂情况十分重要。对体内外细胞分裂的研究方法有很多,但大多数(例如溴化尿嘧啶掺入试验)都只能对少量细胞分裂进行鉴定的缺陷。有些方法可以明确总体的分裂情况(如氚化胸腺嘧啶掺入试验),但无法了解单个细胞亚群的分裂情况。

本方法运用胞内荧光标记琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE or CFSE)跟踪增殖细胞。CFSE在子细胞中均匀分配,可用于细胞周期分裂。该技术适用于体外细胞分裂跟踪,也可用于监测过继输注的细胞体内分裂情况,结合合适的标记物,能够分析8个或以上亚群。

染色剂在细胞内能长时间存在,被染色的细胞能在染色几个月后依然能用于分析。CFSE是FITC衍生物,和FITC的光谱特征一样,因此可以与PE或其它荧光素搭配使用,分析分裂细胞的免疫表型。


该技术于1994年问世,现已成为分析体内外淋巴细胞和其他造血细胞分裂检测的首选方法。。到2012年中期,原始论文(Lyons and Parish, 1994)已被引用超过1100次,在二次文献中被引用的次数更多。CFSE染料稀释法被引进的18年中,人们对其进行了大量的研究。除了被用于检测免疫细胞,其他地方的应用也值得关注,罗列如下:
• 检测胶质母细胞瘤癌细胞的慢速分裂( Deleyrolle et al., 2012).
• 红系祖细胞增殖和死亡速率分析 (Akbarian et al., 2012)
• 清除移植物抗宿主反应的T细胞,这是调节干细胞移植物的一种方法( Deleyrolle et al., 2012).
• 识别儿科小肠移植中容易发生排斥反应的受者(Ashokkumar et al., 2010).
• 用于扩增抗原特异性t细胞克隆方法(Ciantar and Mannering et al., 2011).
• 识别多发性硬化症中的神经抗原特异性T细胞(Ciantar and Mannering et al., 2011)

材料:
单细胞悬液(例如:淋巴细胞、培养的细胞株)
磷酸盐缓冲盐水(PBS; 附录 2A)
0.1% (w/v) BSA
5 mM 5-(and -6)- 琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE or CFSE)
RPMI 1640/10% (v/v)
FBS
培养基
37℃孵箱
配备488nm激发光的流式细胞仪

实验方法:
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发表于 2015-8-28 20:14:48 | 显示全部楼层
这两天看了CFSE检测增殖的所有帖子,受益良多啊,马上要开始做实验了,有个很简单的问题我不知道大家都是怎么做的。就是这个含0.1%BSA的PBS怎么保证无菌呢?因为我们的BSA是固体,称量的时候肯定不能保证无菌,那配完之后可以灭菌吗?
 楼主| 发表于 2015-8-30 21:33:34 | 显示全部楼层
王娟 发表于 2015-8-28 20:14
这两天看了CFSE检测增殖的所有帖子,受益良多啊,马上要开始做实验了,有个很简单的问题我不知道大家都是怎 ...

可以在超净台用过滤培养基的过滤器过滤即可。
发表于 2015-9-1 15:10:15 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-8-30 21:33
可以在超净台用过滤培养基的过滤器过滤即可。

哦,原来是可以过滤的呀,谢谢倪老师!
发表于 2016-10-23 15:25:43 | 显示全部楼层
王娟 发表于 2015-8-28 20:14
这两天看了CFSE检测增殖的所有帖子,受益良多啊,马上要开始做实验了,有个很简单的问题我不知道大家都是怎 ...

其实平时培养细胞所用的胎牛血清也是可以的,作用和BSA类似
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