pe和7aad检测绿色荧光细胞

杨敏

我用PE和7AAD去检测自带绿色荧光的hela细胞，跑出来的流式有些问题：
1、细胞碎片很多。因为我是瞬转后直接实验处理，处理条件是10℃、3天。   我不清楚细胞碎片的原因。图1.是我没做任何处理，常温下的wt细胞。我做流式的步骤是这样的：
（1）收集细胞:六孔板中的完全培养基加入到10ml的离心管中，用PBS洗涤细胞两次，加100ul无EDTA的胰酶，大约1min之后，加入含血清的培养基终止反应，细胞打散后加入到之前的10ml离心管中，离心300 g, 4°C离心5 min 300 g, 18°C离心5 min收集细胞。（离心温度是18°C原因：因为实验室的细胞间常年保持18°C，而细胞间的离心机不能调温度。或者我一定要用调节温度到4°C的离心机？）
  (2).用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300 g, 18°C离心5 min。收集1~5 × 105细胞。
  (3)加入100ul 1 × Binding Buffer重悬细胞.
  (4)加入5 μl Annexin V- EGFP和5 μl PI Staining Solution,轻轻混匀。
  (5)避光、室温反应15 min。
  (6) 加入400 μl 1 × Binding Buffer，轻轻混匀，上机。
2 另外，图2 和图3 分别是一批细胞没有加染料和两种染料都加了的情况，感觉加了染料之后，细胞整体上移，这是不是有问题的？
图4 和 图5分别是一批细胞只加了PE和两种染料都加了的情况，这个有问题吗

niwanmao

1、碎片多不排除是管路和液流中脏的原因引起，可以考虑提高阈值。离心温度不要紧的。
2、加染料的过程中，那些Buffer都是可能对细胞形态造成影响的，但不会影响结果。

小憨

先不说你自己提的问题，来看看你的设计吧
你的仪器是C6，有4个通道，细胞转了带GFP标签的质粒，所以在1通道中有荧光；我猜你的Annexin V是PE标记的，所以2通道也被占了；PI在C6上是用2通道检测的，所以不能用PI，所以是用的7-AAD是吗？我看你标题用7-aad，但是步骤里用的是PI。
至于你问的问题，我自己的经验是：binding buffer里Ca浓度很高，除了含NaCl保持等渗以外也不含缓冲和营养成分，所以细胞长时间在里面可能会不太好，我染色完成后马上就上机检测，越早越好。ssc高了是不是因为PI进入细胞后造成的啊，我猜的。

abcmax

我觉得你的门是用来圈细胞群的，结果你把碎片都圈进去了，还有Annexin V- EGFP和5 μl PI Staining Solution？笔误？

杨敏

不好意思，染料写错了，是PE Annexin V 和 7-AAD