用live/dead kit试剂盒做细菌染色，各位老师看看我的图是否...

小红子

学院新买的贝克曼CytoFLEX，基本没人会用，所有条件只能靠自己摸索，文献看了不少，在论坛也学习了很多东西，找到一个也用live/dead kit做细菌染色的帖子，按照上面的信息自己做了一次，不知图有没有错。


有几个问题想请教各位老师：
1.样品是金黄色葡萄球菌，直径也就0.8微米-1微米左右，很小，不知道增益和阈值设置有没有错。FITC,PE,ECD这三个值是一篇文献上找的。FSC和SSC这两个值是自己设置的，其余是默认值，不知道合不合适
2.阈值是自己设置的，不知道合不合适，总觉得FSC-SSC图不太对，默认值是10的四次方，是在太大，于是从小开始设，
3.没有做荧光补偿，不知需不需要
4.收集的events在3W-4W左右，不知是否足够
5.菌液浓度在OD600 0.08，先前第一次做的时候因为不会调阈值，这次阈值调小了之后发现这个浓度太高了，应该0.03-004比较合适


希望各位老师赐教，不胜感激
还做了活细菌然SYTO9等等图，因为太多了就不一一放上来，如果老师需要看可以联系我

niwanmao

小红子 发表于 2017-7-22 10:37
谢谢老师的回复！我还有几个小问题不知老师可否解答一下
1.一半活和一半死+PI和SYTO9染色的FITC-ECD图中 ...

FITC和ECD散点图类似直线形状跟补偿有关，把FITC－ECD和ECD－FITC调大即可，CytoFLEX可以调节数字，也可以直接拖，只要调到分群比较圆即可。


噪音和菌体，如果你通过Buffer确认过没问题了，那就可以了。BD机器的FSC和SSC区分度确实不错的，其它机器如果分不开，但是你这样确认过了，还是可信的。

niwanmao

用这几个散点图效果挺好的啊。由于在Beckman的仪器上，ECD和PE之间补偿很大，所以PI在ECD、PE通道均可检测。

1、每台仪器的增益和阈值都会有不同，所以无法给你明确的回复，但从检测结果看，是可以的。
2、同上。
3、补偿要调节的，ECD-FITC调大一些。
4、events 3～4万可以，更多当然更好。
5、菌液如果浓度太高，一个可以稀释，另一个可以减慢获取速度。


结果挺好的，加油！！！

小红子

niwanmao 发表于 2017-7-21 22:53
用这几个散点图效果挺好的啊。由于在Beckman的仪器上，ECD和PE之间补偿很大，所以PI在ECD、PE通道均可检测 ...

谢谢老师的回复！我还有几个小问题不知老师可否解答一下
1.一半活和一半死+PI和SYTO9染色的FITC-ECD图中出现了类似直线的形状，不知这是否正常？老师知道是什么原因引起的吗？
2.ECD-FITC调大一些不是很理解？因为这台机子只能在图上拖动调补偿而不能直接设置数字，拖动的时候鼠标出现一行小字（如 -FITC X%），我不是很懂这行小字的意思，不知老师可否解释一下？
3.在SSC-FSC图中好像没明显分出噪声和菌体，以前导师用BD的机子做好像是做出来明显的区分的，图如下，所以我很想知道是否是阈值设置的问题导致没分出来。但我按照这个阈值跑了一次buffer，发现events/s 值很小，但一上样品，值就飙到上万了。