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[流式protocol] OMIP-025:通过胞内细胞因子评估T细胞和NK细胞功能

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发表于 2017-9-11 19:40:59 | 显示全部楼层 |阅读模式

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疫苗是成本效益比最高的干预措施之一,每年可挽救数百万人的生命。 然而,尽管投入了所有的努力,针对艾滋病毒、结核病和疟疾等复杂疾病的疫苗仍然研发困难, 主要障碍之一是缺乏相关特异性保护的鉴别手段,如能有效鉴别出特异性免疫细胞,将可改善和加速这些传染病疫苗的设计和开发。

本方案是从OMIP-014方案(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2518-1-1.html)衍生而来,其中包括了尽可能多的标记,对于样本量有限的情况下(例如婴儿和儿童),在疟疾和结核病疫苗开发工作中, 多色方案是个不错的选择。

方案
15色方案,各个标记的含义我们在后面的图中,结合设门分别解释。
Fig1.png


设门和分析
Fig2.png
图1、首先通过FSC-A/FSC-H排除粘连体,接着通过任意参数+Time散点图,确定液流稳定区域信号,之后通过AViD活性染料和CD14分别排除单个核细胞中的死细胞和单核细胞,最后选择FSC/SSC散点图中的淋巴细胞区域进行分析。

Fig3.png
图2、淋巴细胞群中,CD56+CD3-的NK细胞分两类,一类CD56高表达(0.387%),一类CD56弱表达(1.73%),后者占主要,但在免疫反应中,CD56hi的这类NK细胞重要性不可忽视。另外还可分出CD56+CD3++的NKT细胞(3.31%)


Fig4.png
图3、对淋巴细胞分析,选中CD3+T细胞群,分析CD4、CD8分群情况,分别圈中CD4单阳性的Th和CD8单阳性的Tc,对Th细胞,第三个图可圈出其中CXCR5+CD45RA-的Tfh细胞,对Tfh细胞进一步分析,可圈出其中PD-1hi CCR7low的Tfh前体细胞,这类细胞与次级淋巴组织Tfh分化活化以及抗体产生有关。


Fig5.png
图4、CD4+T(Th)细胞的功能鉴定,从左到右横坐标依次是IL-2、TNF-alpha、IL-4、CD154、IL-21,其中IL-2、TNF-alpha是Th1功能指标,IL-4是Th2功能指标,CD154主要表达在活化CD4+T上,是抗原特异性T细胞相对敏感和特异的指标,IL-21是Tfh免疫调节性因子。需要注意的是,IL-4和IL-21很难检测,抗体的选择和破膜剂效果很关键。 对于CD154需要注意的是,由于BrefeldinA会完全阻断CD154表面表达,所以要进行破膜后染色才行。


Fig6.png
图5、CD8+T(Tc)细胞的功能鉴定,坐标和各因子解释同图4。


Fig7.png
图6、CD4+T细胞CCR7和CD45RA分群情况,可分为naïve (CD45RA+CCR7+)、中央记忆 (CD45RA-CCR7+)、效应记忆 (CD45RA-CCR7−)  和终末效 (CD45RA+CCR7−) 亚群。


Fig8.png
图7、CD8+T细胞CCR7和CD45RA分群情况,可分为naïve (CD45RA+CCR7+)、中央记忆 (CD45RA-CCR7+)、效应记忆 (CD45RA-CCR7−) 和终末效 (CD45RA+CCR7−) 亚群。

如何,一路读下来,是否对免疫细胞的分析有了不少收获?

参考文献:
Moncunill, Gemma., Dobaño, Carlota., McElrath, M Juliana., De Rosa, Stephen C.. (2015). OMIP-025: evaluation of human T- and NK-cell responses including memory and follicular helper phenotype by intracellular cytokine staining., Cytometry A, 87(4), 289-92.




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发表于 2017-9-13 16:11:50 | 显示全部楼层
QQ截图20170913160949.png 老师 想请问横坐标为什么可以同时表示CD14和AViD 这两个指标的荧光素都是BV510么?
 楼主| 发表于 2017-9-14 08:01:00 | 显示全部楼层
Shura 发表于 2017-9-13 16:11
老师 想请问横坐标为什么可以同时表示CD14和AViD 这两个指标的荧光素都是BV510么?
...

CD14是BV510标记的,Live/Dead染料可选BV510通道的。
发表于 2017-9-14 09:52:21 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-9-14 08:01
CD14是BV510标记的,Live/Dead染料可选BV510通道的。

那请问就是同一个通道对应两种指标是么
 楼主| 发表于 2017-9-14 10:06:35 | 显示全部楼层
Shura 发表于 2017-9-14 09:52
那请问就是同一个通道对应两种指标是么

是的。
发表于 2017-9-14 10:14:57 | 显示全部楼层

还可以这么做啊 学习了 感谢
发表于 2017-11-20 16:16:06 | 显示全部楼层
我想请问下CD3-CD56+和CD56+差别在哪?
 楼主| 发表于 2017-11-20 20:03:18 | 显示全部楼层
zqlaser 发表于 2017-11-20 16:16
我想请问下CD3-CD56+和CD56+差别在哪?

CD56+如果不加CD3,会混进少量CD56+CD3+的NKT
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