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手把手教你做T细胞钙离子动员实验

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-3-23 11:08| 查看数: 382| 评论数: 0|帖子模式

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T细胞受体(TCR)的抗原识别和活化,可触发钙离子从细胞间瞬间流入,随后通过细胞表面Icrac通道持续流入。 胞浆内钙离子水平的持续升高可激活许多钙依赖性酶和转录因子,这对于T细胞活化和功能是必需的。这个Protocol使用非比率染料,结合流式细胞仪,可监测TCR引发的钙离子随时间的变化,也是检测转基因小鼠中T细胞钙离子动员缺陷的简单测定方法。
材料和试剂
  • Anti-CD3 Armernian hamster primary antibody (BD Biosciences, catalog number: 553057, NA/LE)
  • Goat anti-Armernian Hamster IgG antibody (Jackson ImmunoResearch, catalog number: 127-005-099)
  • Phosphate buffered saline (PBS)
  • CaCl2
  • MgCl2
  • DMSO (Merck KGaA, Calbiochem®, catalog number: 540025)
  • Fluo-3 AM in DMSO (Life Technologies, Molecular Probes®, catalog number: F-1242)
  • Fura Red AM in DMSO (Life Technologies, Molecular Probes®, catalog number: F-3020) (注:Fura Red荧光素是非钙离子依赖的,Fura Red作为染色效率的对照)
  • Pluronic F-127 in DMSO (Life Technologies, Molecular Probes®, catalog number: F-1242) (see Recipes)
  • Hanks buffered solution (HBSS) (Life Technologies, Gibco®, catalog number: 14170-112) HBSS/Ca/Mg/FBS,配方如下:
    HBSS
    20 ml
    1 mM CaCl226 μl
    1 mM MgCl222 μl
    FBS200 μl
  • Dye loading buffer (配方如下)
    HBSS/Ca/Mg/FBS
    2 ml
    10% pluronic F-1274 μl
    4 mg/ml Fluo-3 AM2 μl
    10 mg/ml Fura Red AM2 μl

仪器
流式细胞仪

步骤
  • 每个样本准备dye loading buffer 2ml。
  • 将细胞调整浓度,使其在1ml dye loading buffer里面的终浓度为5 × 10E6个/ml,37 °C孵育30分钟,然后1000rpm离心5分钟。
  • 细胞以5 μg/ml anti-CD3 hamster primary antibody (不含叠氮钠)标记,置于冰上或4 °C孵育30分钟。
  • 洗涤细胞一次。
  • 用3 ml HBSS/Ca/Mg/FBS重悬,重悬细胞密度3 × 10E6 cells/ml,室温避光保存。
  • 钙离子动员前,先将样本在37 °C预热5–10分钟,然后在流式细胞仪上检测钙离子基准水平。5分钟后,加入5 μg/ml goat anti-hamster IgG antibody (15 μg/3 ml),充分混合,立即开始持续检测钙离子水平变化。为了维持孵育温度,可在检测期间将样本管浸在一个盛有37°C温水的小烧杯内。

最后得到的图大多是这样的:
屏幕快照 2017-10-08 下午8.29.32.png

具体的钙离子内流分析步骤,包括设门、分析、曲线绘制,详见http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6195-1-1.html

参考文献:
Huang GN. T Cell Calcium Mobilization Study (Flow Cytometry). Bio Protoc. 2012 May 5;2(9). pii: e171. doi: 10.21769/BioProtoc.171.

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