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细胞之间的深情相拥

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-3-27 15:42| 查看数: 421| 评论数: 0|帖子模式

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问题
一位站友问,是否能鉴别由于Cell-in-Cell作用被肿瘤细胞吞噬的淋巴细胞亚群?

背景和资料
广东的Meifang He等人在2015年的Sci Rep上发的文章,里面介绍的背景和检测方法挺好,特编译分享:
数十年来,病理学家在各种人类肿瘤样本中看到了一种特殊结构,就是形态正常的细胞被其它细胞包裹着。 曾经有一些术语,如“细胞自相残杀”和“细胞吞噬作用”等被用来描述这些独特的结构,直到2008年开始才被赋予统一的名称“cell-in-cell”结构(CICs)。

根据参与结构形成的细胞种类不同,CIC可大致分为两类:
1)同型CIC,结构由相同类型的细胞形成,如上皮细胞;
2)异型CIC,结构由不同类型的细胞形成,例如由上皮细胞和淋巴细胞共同形成。

对CIC的研究成为近年来的研究热点,很大程度上是由于形成CIC会导致大部分内化细胞死亡,其中entosis可能是同型CIC细胞死亡机制。 最近的研究表明,CICs的形成在免疫稳态和肿瘤发生中起着重要作用,可能是进化上保守的现象。 从机制上看,CICs的形成可能反映了相遇的细胞之间的竞争性,代表了细胞竞争的新机制。

对CIC日益增高的研究需求,需要有更可靠的方法来辅助。研究entosis的方法中,同型CIC大多通过显微镜观察手动定量。虽然同型或异型CIC均可通过显微镜观察定量,但这种方法对于多个样品来说相对主观且费力、费时。流式细胞术是一种理想的高通量方法,可快速定量分析CIC。

在实验中,作者采用了PLC/PRF/5、MCF7、SK-BR-3、RD、Molt-4、Raji、BxPC3、NK92MI等细胞株。肿瘤细胞事先用2.5uM CellTracker Green CMFDA于37度无血清孵育标记30分钟,然后以含10% FBS的DMEM培养基在6孔板37度培养12小时使其贴壁,初始细胞量3.5×10E5/孔。
免疫细胞则用10ul CD45 PE室温标记20分钟,然后与肿瘤细胞共培养(也是每孔3.5×10E5细胞)。
孵育一定时间后,去除培养基,倒掉脱落的细胞,用D-PBS洗涤,接着用0.25% trypsin/EDTA(每孔300ul,37度)消化,直至贴壁细胞解离,加入等体积的含20% FBS的HBSS液终止反应。接着通过150×g离心5 分钟,以400ul 含20% FBS的HBSS液重悬,过滤、上机。

这里,文章中着重探讨了避免粘连细胞对CIC信号影响的最佳条件,发现20% FBS是比较好的。

结果图形如下:
屏幕快照 2018-03-27 下午3.26.39.png

鉴别被吞噬细胞类型
如前面那位站友所问,他们采用CD3 PE标记被吞噬的淋巴细胞,然后用流式分选,很多次均成功分选出CIC细胞,但他们希望进一步知道究竟被吞的是哪类淋巴细胞。
我的建议是增加标记,例如标记CD3、CD4、CD8等多个抗体标记淋巴细胞,再去让肿瘤细胞吞噬,看CD45-细胞群体中CD3+亚群中,CD4、CD8的表达。而站友担心的是标记这么多抗体,是否会影响吞噬?
此外,我还在想,如果按照他们之前的步骤分选出CIC细胞之后,再通过固定、破膜,标记细胞内被吞噬淋巴细胞的CD4、CD8,是否也可以?

这两个方法,如果你有CIC方面的经验,欢迎留言讨论一下这两个方案的可行性,或者你是否有更好的方法?


参考文献:
Overholtzer, M. & Brugge, J. S. The cell biology of cell-in-cell structures. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 796–809, 10.1038/nrm2504 (2008).
He M, Huang H, Wang M, et al. Fluorescence-Activated Cell Sorting Analysis of Heterotypic Cell-in-Cell Structures. Sci Rep. 2015 Apr 27;5:9588. doi: 10.1038/srep09588.

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