流式中文网 门户 查看主题

流式补偿方法的最佳实践

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-9-10 11:35| 查看数: 494| 评论数: 0|帖子模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?加入流式中文网

x
为什么会有补偿
每种荧光素有其最大发射波长,就是说它在那个波长的光子数量是最多的,但是在相邻的若干纳米范围内,还是有其它波长的光子,只不过相对较少,这些不同波长的光子汇总成一个呈近乎正态分布的图形,如下图所示,FITC荧光素尽管在524nm的光子数量最多,但在585nm以上,仍有相当数量的光子,这些光子就容易跑错门,跑到585nm通道,形成一定的信号:
Fluorescein-emission-profile.png

调不调补偿,有什么差别?

如果你只是单标一个FITC,那么这些光子跑错了门就算了,不调节补偿,对我们要检测的信号,没有任何影响,反正它们漏过去的那通道我们不需要分析。 但如果是多个荧光素,并且发射光谱之间有重叠就不能就这么算了,看一下图像,没调补偿是这样子的:
Demonstration-of-the-results-of-uncompensated-cells.png

调好补偿是这样子的:
Demonstration-of-the-results-of-compensated-cells.png

怎么调补偿?
在初期,曾有人说不用调补偿,而是通过如下设门,对各荧光单阳性和双阳性区域进行设门:
Uncompensated-FITC-and-PE-data-from-multiple-samples-and-multiple-machines.png

后来,改为手工调补偿,将单阳性群体的阴性指标MFI调节到和阴性群的阴性指标MFI一致,如下图是Calibur上面的补偿调节,应该很熟悉吧:
Manual-compensation-By-adjusting-the-percentages-the-positive-sample-was-adjuste.png

那么究竟调到多少算到位呢?看下图,你可以分别记录下补偿值0%、20%、25%、30%时对应的阳性细胞群、阴性细胞群的阴性指标MFI:
Using-Statistics-to-optimize-compensation-in-flow-cytometry.png

接着,对这些指标,在Excel或其它统计学软件上绘图,拟合出线性方程,两条直线交叉的位置,就是最佳的补偿值(对于上面这例,最佳补偿值大约在24.445%):
Using-matched-medians-and-algebra-to-determine-the-compensation-value-of-FITC-in.png

但这两个方法在双色,还可以用用,一旦到3色以上,互相之间并非单因素影响,就不能如此简单计算了。就需要用到目前大多仪器配套软件都具备的自动补偿功能了。用各荧光素抗体进行单染(需要细胞对各个抗体均能分出阳性群和阴性群,如果某抗体没有明显分群,可采用相同荧光素其它抗体代替),获取完之后,自动补偿的计算方式是对每一种可能产生的干扰荧光素,列出一个矩阵:
Matrix-algebra-representation-of-the-compensation-process.png

看到这个公式是否已经晕了?幸好我们自己不需要手工计算,各软件都有自动补偿程序,可以帮我们计算好。

现在有自动补偿微球,其原理就是微球可以结合各种抗体,结合未染的微球,就可以形成明显的阳性群体和阴性群体,所以很容易做自动补偿,不过在实践中,我们可以发现由于微球的很多特性和细胞不一样,所以导致最后产生的补偿值与细胞相差较大。因此,如果有可能,尽量用细胞。


看完这么多,你应该大致懂了原理吧,更多实战方面的技巧和资料,可访问论坛搜索『补偿』,以下是部分资料链接:
天,为什么我的补偿调不好(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6163-1-1.html
从一幅图看补偿是否调整到位(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2890-1-1.html

信源:ExpertCytometry,https://expertcytometry.com/best ... tion-methodologies/

最新评论

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

流式中文网    

联系我们: mail#flowcyto.cn (#改为@)

GMT+8, 2018-10-18 08:54

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.