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一步一步”爬“上多色流式这座山

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-9-11 19:18| 查看数: 338| 评论数: 3|帖子模式

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多色流式,是将流式单细胞检测能力发挥到极致的趋势性技术,颜色越多,从每个细胞上面获得的信息就越多。
但是,多色流式,是目前流式技术的一个痛,尽管质谱流式解决了这个痛点,但高昂的成本,使得质谱流式给普通用户又设了一道门槛。
所以,做好当前常规流式的多色方案设计,就成了必须做的一件事情。

这里有个Abcam出的简洁版PDF,将多色流式设计分为5步,值得大家参考(https://docs.abcam.com/pdf/immunology/multicolor-flow-cyometry-panel-design.pdf),在此将此PDF简介一下,同时穿插一些相关资料辅助解读。
1、了解你的流式细胞仪,包括激光器和滤光片
屏幕快照 2018-09-11 下午5.59.36.png 屏幕快照 2018-09-11 下午5.59.42.png

2、了解你要检测的细胞群体需要通过检测哪些抗原来区分,这些抗原的表达量如何?通常低表达或未知表达量的抗原用高亮度的荧光素,而高表达的抗原可用弱的荧光素:
屏幕快照 2018-09-11 下午5.59.53.png 屏幕快照 2018-09-11 下午6.00.04.png

说到这里,肯定有FLOWER会问,究竟哪些荧光素亮,哪些是弱的呢?不急,热心的Biolegend提供了一张表,他们用各种荧光素标记的CD4检测单个核细胞,通过形成的直方图来评估各种荧光素的染色亮度,排序如下(https://www.biolegend.com/brightness_index),这可以作为荧光素亮度选择的一个依据:


Fluorophore
Ex (nm) Max
Em (nm) Max
Filter Used
Brightness
Histogram
PE
565
575
585/20
5

                               
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PE/Cy5
565
670
660/20
5

                               
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PE/Dazzle™ 594
565
610
610/20
5

                               
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Alexa Fluor® 647
650
668
660/20
4

                               
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APC
650
660
660/20
4

                               
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Brilliant Violet 421™
405
421
450/50
4

                               
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Brilliant Violet 711™
405
711
710/50
4

                               
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PE/Cy7
565
774
780/60
4

                               
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PE/Fire™ 780
565
774
780/60
4

                               
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Brilliant Violet 605™
405
603
610/20
3

                               
登录/注册后可看大图
Brilliant Violet 650™
405
645
660/20
3

                               
登录/注册后可看大图
Brilliant Violet 750™
405
750
780/60
3

                               
登录/注册后可看大图
Brilliant Violet 785™
405
785
780/60
3

                               
登录/注册后可看大图
Alexa Fluor® 700
696
719
720/45
2

                               
登录/注册后可看大图
APC/Cy7
650
774
780/60
2

                               
登录/注册后可看大图
APC/Fire™ 750
650
787
780/60
2

                               
登录/注册后可看大图
PerCP/Cy5.5
482
690
695/40
2

                               
登录/注册后可看大图
PerCP/Cyanine5.5
482
690
695/40
2

                               
登录/注册后可看大图
Alexa Fluor® 488
495
519
530/30
1

                               
登录/注册后可看大图
Brilliant Violet 510™
405
510
510/50
1

                               
登录/注册后可看大图
Brilliant Violet 570™
405
570
585/42
1

                               
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FITC
493
525
530/30
1

                               
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Pacific Blue™
410
455
450/50
1

                               
登录/注册后可看大图
PerCP
482
675
695/40
1

                               
登录/注册后可看大图


3、最小化荧光渗漏。对于比较重要的检测指标,尽量使用No Overlap的两个荧光通道:
屏幕快照 2018-09-11 下午6.02.02.png

4、尽量包含以下的对照:
未染色对照
屏幕快照 2018-09-11 下午6.03.26.png

死活染色
屏幕快照 2018-09-11 下午6.03.30.png

单染阳性对照,设置补偿
屏幕快照 2018-09-11 下午6.03.34.png

FMO对照,设置阳性门
屏幕快照 2018-09-11 下午6.03.38.png


5、尽管通过上面几步可以很好的完成实验了,但做好第5步,可以使实验结果更稳定可靠,就是滴定抗体、Fc阻断:
屏幕快照 2018-09-11 下午6.03.47.png 屏幕快照 2018-09-11 下午6.03.52.png

怎么样?看完这本“爬山”攻略,对征服这座大山有信心吗?



最新评论

btx362237729 发表于 2018-9-13 10:15:31
Fc受体阻断剂有没有推荐的呢?谢谢
mybiosciences 发表于 2018-9-16 10:48:24
倪老师,能否分享一下您使用串联染料的经验?
niwanmao 发表于 2018-9-16 19:29:55
mybiosciences 发表于 2018-9-16 10:48
倪老师,能否分享一下您使用串联染料的经验?

感慨颇多,比较关键的是:
1、避光。
2、尽量不要预混。
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