请教：大鼠外周血T细胞亚群检测

xcbwxf

（1）需要将一份样本分为两份进行检测（分别检测Th1/2/17、Treg），检测Treg的样本（染Foxp3）是否需要刺激培养？（由于要计算Th17/Treg比例，两份样本做相同的处理会好一些？）
（2）两份样本的胞内/核内单染均没有染上，考虑可能是固定/破膜步骤的问题（图1中Foxp3没有染上），用的试剂是BD 562574 Transcription factor buffer set，并按试剂说明操作（Fix/Perm 4度 40~50min，离心力提高到了1200g约3500rpm），不知道下一步如何改进？（Fix/Perm改为室温避光30min?换用其它的固定/破膜试剂？）
（3）另外，在检测Th1/2/17时，设置的CD3+CD4+双染对照出现了IFN-g、IL-4、IL-17阳性细胞（图2，图3是检测样品的结果），这种情况应当如何处理？

niwanmao

1、foxP3一般情况下不需要刺激。如果希望进行诱导，也可以另外加因子培养。
2、foxP3的破膜剂挺难选择，目前还是eBioscience的foxP3 破膜剂口碑最好。
3、如果对照组也出现类似的信号，需要排除以下可能性：抗体错加；样本错加；补偿问题；

xcbwxf

niwanmao 发表于 2018-10-25 01:46
1、foxP3一般情况下不需要刺激。如果希望进行诱导，也可以另外加因子培养。
2、foxP3的破膜剂挺难选择，目 ...

谢谢倪老师！
再问一下您，为了去除非特异性染色，已通过死活染料去除死细胞，胞内染色未出现明显的阳性峰，这种情况是否可以调补偿？还是必须要用补偿微球才能调补偿？
另外，未刺激的样品（生物学对照）出现胞内染色阳性信号是否只能在计算的时候人为减掉？如果是这样，是否每一个独立的样本都要做生物学对照？

niwanmao

xcbwxf 发表于 2018-11-1 21:21
谢谢倪老师！
再问一下您，为了去除非特异性染色，已通过死活染料去除死细胞，胞内染色未出现明显的阳性 ...

没有阳性峰就没法调节补偿。
用补偿微球可以，但无法完全替代生物样本。
减掉未刺激样本的信号比例，是以前ELISA的做法，曾经在某些流式文章中也看到过，但我个人不是特别建议。

xcbwxf

niwanmao 发表于 2018-11-2 10:15
没有阳性峰就没法调节补偿。
用补偿微球可以，但无法完全替代生物样本。
减掉未刺激样本的信号比例，是以 ...

好的，非常感谢！