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用AV/PI测凋亡没法同时做胞内标记?解决方法来了

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-11-29 15:58| 查看数: 159| 评论数: 0|帖子模式

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非常感谢流式中文网热心站友@happyeday (北京医科院基础所 刘晓玲老师)的素材编译

Annexin-V/PI是一个常用的分析细胞凋亡的流式检测方法。然而,AV/PI法不能对细胞进行固定,所以必须染色后短时间内就检测掉,也不能进行破膜,故不能同时检测细胞内标志物。此外,因为无法固定,所以对研究有生物安全威胁的病原体感染细胞也造成了较大困扰。

意大利的Mariotti S等人提出了一个改良方法,解决了这个困境,命名为Fixed Aprototic/Necrotic(简称FAN)。
FAN的原理和AV/PI相似,但是为了能够允许染色后对细胞继续固定和破膜,所以将Annexin V改成了荧光素标记的抗磷脂酰丝氨酸抗体(文中用的是Alexa Fluor-488标记的α–PS,你也可以用其它的),PI改成了荧光素标记的游离胺染料(文中用的是ViDs染料,你也可以改用其它胺类染料)。

FAN法与AV/PI法的对比,未进行细胞固定(第一行为AV/PI法检测结果,第二行为FAN法检测结果,左列为正常培养的细胞,右列为用十字孢碱诱导凋亡的阳性对照,判读方法同AV/PI,即左下象限为活细胞,右下象限为早期凋亡,右上和左上象限为死细胞):
2018112901.png

细胞固定前和固定后,FAN法与AV/PI法的对比,很明显看出FAN的结果在固定前后无差别:
2018112902.png

这样固定之后,样品过两周再检测都没问题。

由于固定可以灭活感染的病原体,所以特别适合有生物安全性需求的实验,例如检测结核分枝杆菌(Mtb)的巨噬细胞(培养第1天和第3天,第一行为未感染Mtb的巨噬细胞,第二行为感染了Mtb的巨噬细胞):
2018112903.png
并且同时可以用红色荧光标记的Mtb、荧光素标记的抗TNFα和抗MHCII单克隆抗体,检测巨噬细胞吞噬功能和发生的功能分子变化。

对于一些功能性实验,例如CD4+T细胞在无IL-2的条件下培养3天,接着用PMA和离子霉素刺激5小时,同时用BFA阻断,接着进行表面染色和胞内细胞因子IL-4和IFN-γ染色,效果挺好,不同状态的细胞中不同的因子表达率,甚至也可以分析不同细胞群体中的凋亡情况:
2018112904.png

怎么样?这个方法不错吧。

再次感谢刘晓玲老师热心提供素材,也真心希望其它热心站友能够给我们提供一些您觉得有意思或者比较有特色的素材,我们的邮箱是mail@flowcyto.cn,谢谢!

参考文献:Mariotti S, Pardini M, Teloni R, et al. A method permissive to fixation and permeabilization for the multiparametric analysis of apoptotic and necrotic cell phenotype by flow cytometry. Cytometry A. 2017 Nov;91(11):1115-1124.

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