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流式细胞仪在实体器官移植上的应用,一切都是为了匹配

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-12-18 22:17| 查看数: 366| 评论数: 1|帖子模式

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同种异体实体器官移植的主要临床挑战是控制细胞和体液免疫应答以防止移植器官的排斥,同时保持对机会性感染的有效保护。

移植后HLA抗体监测
对HLA系统的多态性同种抗原的免疫应答是实现实体器官成功移植的主要障碍。器官移植受者中的细胞免疫应答通常由复杂的免疫抑制方案控制,然而,体液反应仍然有很大临床挑战性。

抗体介导的排斥(AMR)的病理学涉及一系列复杂的免疫事件,主要涉及抗移植物组织中血管内皮细胞的抗HLA抗体和活化补体。因此,除组织学检查结果外,AMR的明确诊断还需要抗体和补体沉积的证据(Colvin,2007)。然而,在活组织检查中很少检测到免疫球蛋白和主要补体成分C3。相反,补体切割片段C4d和循环 供体特异性抗体(DSA) 却能够提供较好的血清学证据(Racusen&Haas,2006)。通常,临床上AMR主要分为三大类:超急性、急性和慢性。超急性排斥是由于预先形成的同种异体抗体而发生的直接且不可逆的AMR形式。相反,急性和慢性AMR则涉及DSA的新形成。

历史上,补体依赖性血清学方法为检测供体靶向的HLA抗体提供了金标准(Pietroni等,2013)。这些测定使用供体来源的或抗原相似的第三方外周淋巴细胞作为移植组织的替代物,在商品化补体作用下,以活性染料确定患者血清对供体白细胞的细胞毒性作用。这项检测的结果解读直截了当,但还是有较大的缺陷(Akalin&Pascual,2006)。

既往认为,细胞毒性抗体的存在预示着移植物会被破坏,而它们的缺失则说明预后良好。这项理论基于两个关键假设:首先,在细胞毒反应中可检测到所有能够介导排斥的抗体。其次,检测到的所有抗体都对移植物存活有害。但是这两种假设无法囊括的现象并不罕见。偶尔,通过细胞毒性方法鉴定的淋巴细胞抗体既不识别HLA也不介导排斥,特别是那些具有自身免疫性质的抗体。此外,尽管IgM类抗体能够补体激活,但在临床上是无关紧要的。因此,该方法假阳性就比较多,特异性较差。
此外,细胞毒性检验也易于产生假阴性结果,因此灵敏度较差。低滴度抗体可能无法在体外启动补体激活,但仍然能够在体内补体依赖性排斥。还有,一些免疫球蛋白亚类可能无法完全固定补体,但仍然通过与携带Fc受体的炎症细胞的相互作用介导排斥。如果使用第三方淋巴细胞,由于HLA抗原的微小差异也可能导致假阴性结果。尽管I类抗原普遍由大多数有核细胞表达,但II类抗原的表达大多限于专职抗原呈递细胞。因此,除非采用繁琐的细胞分离或富集程序,否则临床上重要的II类抗体可能未被检测到。

移植流式细胞术的发展克服了补体依赖性方法的许多局限性(Scornik,1995)。间接免疫荧光提供的增强的灵敏度有效地补偿了低滴度抗体。亚群特异性单克隆抗体的使用允许区分不同细胞亚群以鉴定抗I类和II类抗HLA抗体。此外,流式细胞术独立于补体结合检测抗体的能力使得能够鉴定更广泛的临床相关免疫球蛋白。流式细胞术方法的发展也提高了测定的特异性,通过使用IgG特异性探针,基本上消除了非特异性IgM类自身和同种抗体的假阳性反应。

移植后基于供体细胞的补体依赖性反应存在不少问题,一是供体细胞来源问题,尤其是来自已故器官供体的细胞,二是即使利用了冷冻细胞,其细胞活力和抗原完整性仍然值得怀疑。因此,无细胞固相分析开始出现并发展,其中代表性的是基于Luminex平台使用HLA包被的微球(Tait等,2009)检测HLA I类和II类表位,可定量测量抗体。此外,该测定还能通过利用补体特异性(C1q)探针辨别细胞毒性和非细胞毒性HLA抗体的修饰(Yabu等人,2011)。

作为诊断工具,班夫标准需要DSA和C4d沉积的血清学证据。通过微球阵列技术能可靠检测DSA(Hiririan等人,2009),DSA抗体的存在与局灶性和弥散性C4d沉积相关,因此证明了其确证价值,而当C4d无法检测到时,在某些AMR病例中也能检测到DSA(Zeevi等,2009)。
从预后的角度来看,通过微球阵列分析进行的DSA监测被证明是非常有用的。据报道,多达30%的肾移植受者出现新的DSA,其中,近三分之二的人经历了急性排斥反应(Piazza 等,2011)。其他研究表明,在DSA存在的情况下,急性AMR发生率是常常的两倍,10年移植物存活率可能会降低40%(Wiebe等,2012)。因此,早期识别DSA可实现早期干预。

管理移植后的机会性感染
机会性感染是移植后移植物存活的重要并发症。感染的最常见原因是人巨细胞病毒(CMV)。 CMV影响美国50-80%的人口,全球40%的人口(Bate等人,2010)。尽管CMV感染的发病率很高,但免疫功能正常的人通常是无症状的,而免疫受损的移植后患者却特别容易再次感染病毒,随后发展为CMV疾病。在移植后至少100天,所有受者需常规开具预防性抗病毒药物如更昔洛韦。如果在高风险患者中停止预防(即供体阳性,受体阴性),大约40%的患者会发生致命的CMV疾病(Humar等,2010)。
然而,话又说回来,一般而言,不建议延长抗病毒治疗,因为更昔洛韦具有细胞毒性,并且会对患者造成许多严重的副作用。

历史上,CMV再激活的临床检测主要是通过ELISA或PCR检测血清抗体水平,这些测试仅仅是对实体器官移植中CMV再激活的弱预测(Humar等,2005),并且无法提供关于CMV细胞起源的信息。

移植后感染的免疫监测的最新进展集中于用荧光标记多聚体检测 CMV抗原特异性T细胞(CAST) ,检测CD8 + CAST的干扰素γ(IFNγ)产生,尽管比传统ELISA更具特异性,但该测定在研究中取得了成功并且无法准确预测CMV再激活(Westall等,2008)。

最近的研究发现,大量的CD8+和/或CD4+CAST对CMV疾病具有保护作用(Bunde等,2005; Eid等,2010; Gerna等,2011; Kumar等,2009)。此外,Egli等人发现,CD4 + CAST和总Treg可能是CMV疾病更准确的预测因子(Egli等,2012)。CAST细胞的产细胞因子功能现在越来越受到关注。

除CMV外,Epstein-Barr病毒(EBV)是另一种重要的移植后并发症,主要导致移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)(Allen&Preiksaitis,2009)。与CMV一样,大多数健康人感染了潜伏的、无症状的EBV,但免疫功能低下的移植受者具有重新激活的重大风险。由于最初的EBV感染通常发生在青春期,因此儿科移植受者特别容易受到原发感染。 EBV/PTLD的治疗通常包括减少免疫抑制,使得T细胞恢复以限制EBV+B细胞复制。而免疫抑制的减少或暂时停止具有很高的移植物排斥风险,因此需要临床测试来准确预测PTLD的发展。

含有EBV肽的多聚体可以鉴定抗原特异性T细胞并允许监测移植后的EBV再激活。通过流式细胞术监测CD8+/HLADR+特异性T细胞以及CD19+/CD23+B细胞中的EBV可以作为PTLD的预测因子(Imadome等,2012; Sato等,2008)。与CMV一样,现在重点是转向EBV特异性T细胞的产细胞因子功能监测(Guppy等,2007)。

未来使用多色流式细胞仪将允许同时分析CMV和EBV特异性T细胞以及这些细胞内细胞因子产生功能,或许可提供移植受者主要机会性感染易感性的个性化特征。

监测调节性免疫细胞和其它亚群
在实体器官移植的细胞免疫检测中,最常见的是CD3+T细胞计、CD4+:CD8+比率以及CD3+或CD8+ T细胞上CD69或HLA-DR的表达(Cosimi等,1981; van Es等,1984 ; Xavier等,2014)。对于那些已经接受抗IL-2受体抗体(即巴利昔单抗)作为其治疗一部分的患者,流式细胞术用于确认CD25阻断(Baan等,2012)。

随着流式细胞术的发展,多色流式可以检测到更多的免疫细胞亚群,包括了NK细胞、树突状细胞(DC)、调节性T细胞(Treg)、髓样抑制细胞(MDSCs)、调节巨噬细胞(Mregs)和其他抑制细胞亚群。其中CD4 + Tregs最受关注,因为它们在移植后患者移植物排斥风险密切相关。因此,为了改善移植耐受性,临床上可能会进行干预以使受体Tregs免于耗竭,在移植排斥期间或之后扩增供体特异性Treg以输注给患者(Hippen等人,2011; Loewendorf& Csete,2013; Tang等,2012)。在实验模型中雷帕霉素和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)也可以诱导Tregs增殖,这在临床干预中可能会有较好的应用前景(Battaglia等,2005; Boenisch等,2012; Hester等,2012)。

移植环境中免疫监测的一个重要目标是了解Operational Tolerance的情况,这是指在没有采用药物进行免疫抑制的情况下免疫系统有效忽略移植器官的情况,这是一个理想的结果,因为重大问题与长期抑制治疗相关,如加速心血管疾病、感染和恶性肿瘤(Baan等,2012; Vincenti等,2005)。目前的临床试验已采用多参数流式细胞术发现了Operational Tolerance的患者表现出pDC2:pDC1比率增高、总活化CD4+细胞增高、以及NK细胞和B细胞的频比例升高(Mazariegos等,2003; Sagoo等, 2010),增高的B细胞主要是初始、过渡型的B细胞表型(Newell等,2010; Newell等,2011)。
此外,Operational Tolerance患者中的这些过渡性B细胞能产生更多的IL-10,说明这些B细胞可能以调节方式起作用。
与Operational Tolerance相关的其它细胞还有γδT细胞亚群比例。

细胞功能测定
流式细胞术微球定量检测血清IL-6和FGL2在体外研究中可预测急性排斥反应(De Serres等,2012; Zhao等,2013)。然而,该方法具有与ELISPOT分析相同的缺点,就是不能用于找出产生细胞因子的细胞。通过流式细胞术的细胞内细胞因子检测,可以克服该缺点。多色流式细胞仪的进展扩展了可以从这些测定中获得的信息。现在可以分析多亚群中多种细胞内细胞因子水平刺激后的变化(Ahmed等,2001),其中产生IFNγ的Tregs(iTregs)与肾移植物存活的有利结果相关(Daniel等人,2008)。对涉及iTreg功能的因素的研究已经确定CD28、CD95、CD152、CD178、CD278和HLA-DR是产生有利结果的重要分子(Daniel等人,2012)。

许多信号传导途径依赖于信号传递中间体磷酸化状态的翻译后修饰。随着磷酸特异性抗体的发展,流式细胞术现在通过检测相关途径的信号转导活性,在研究免疫细胞的功能中发挥重要作用,例如最近使用磷酸特异性流式细胞术的研究表明,免疫抑制药物可抑制许多信号通路,包括NFAT、NF-κB/p65、ERK和MAPK。 屏幕快照 2018-12-18 下午10.27.23.png
(图片转自An optimized protocol to quantify signaling in human transitional B cells by phospho flow cytometry)

结语
在实体器官移植后监测免疫功能对于确保移植物和受体的存活至关重要。 流式细胞仪能够提供有关受体免疫状态极具价值的信息。 虽然指标很有价值,但应该注意的是,本文中讨论的许多流式检测方法均需尽量标准化后,才能在临床上广泛应用。

参考文献:
Maguire, Orla et al. “Flow cytometry and solid organ transplantation: a perfect match” Immunological investigations vol. 43,8 (2014): 756-74.


最新评论

程小贼的陈大人 发表于 2019-2-27 16:20:58
标准化真的太难了
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