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OMIP-042:人外周血21色方案髓系免疫细胞、T、NK亚群深度分析

发布者: niwanmao | 发布时间: 2018-12-19 09:09| 查看数: 1076| 评论数: 8|帖子模式

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单管21色方案分析人外周血髓系免疫细胞亚群,并深度分析T、NK淋巴细胞
好方案,可遇不可求。


方案
抗体
荧光素
克隆号
用途说明
CD14BUV395MUP9单核细胞标记
Live/Deadn/an/a死活鉴别染料
CD16BUV4963G8单核细胞亚群标记
HLADRBUV661G46-6DC标记
CD56BUV737NCAM 16.2NK标记
CD38BV421HIT2活化标记
CD20BV450L27B细胞标记
CD4BV510SK3CD4+T细胞标记
CD194/CCR4BV605L291H4Th亚群标记
CD8BV650RPA-T8CD8+T细胞标记
CD25BV7112A3Treg标记
CD196/CCR6BV785G034Th亚群标记
CD3AF488UCHT1T细胞标记
CD45RAPerCP-Cy5.5HI100区分初始/记忆T
CD183/CXCR3PE1C6Th亚群标记
CD197/CCR7PE-CF594150503中央/效应T细胞标记
CD11cPE-Cy5Bly6mDC标记
CD185/CXCR5PE-Cy7RF8B2Th亚群标记
CCR10APC314305Th亚群标记
CD123AF70032703pDC标记
CD127APC-eF780RDR5Treg标记


分析流程
第一步圈出活力好的白细胞。仍然是最常规的圈白细胞区域(因为要分析髓系组成,所以只要圈中白细胞,排除掉碎片/红细胞即可),然后通过FSC-A/FSC-W排除粘连体(也可以用A/H或FSC/TOF等,根据机器选择对应的排粘连指标),接着通过Live/Dead排除死细胞。
2018122001.png

第二步,在白细胞中,利用CD3/CD20简单分出总T细胞、总B细胞以及非B/T细胞三大类。
2018122002.png

第三步中,主要是分出主动免疫的细胞亚群,略显复杂,但比后面的T细胞分群要好一些。非B/T细胞通过HLA-DR/CD14分出CD14++的单核细胞、HLA-DR+CD14-的DC、HLA-DR-CD14-的粒细胞/NK细胞三大群。单核细胞进一步通过CD16/HLA-DR分出CD16-的经典型单核和CD16+的非经典型单核,以及HLA-DR dim/-的亚群(其中可能有Mo-MDSC);DC继续通过CD11c/CD123分为CD123++的pDC、CD11c+的mDC;粒细胞/NK群体通过CD56/CD123分为CD56+CD123-的NK、CD56-CD123+的嗜碱粒细胞、CD56-CD123-的中性粒细胞,这里的NK进一步通过CD56/CD16分出CD16+常规NK主群、CD56hi CD16lo的NK亚群、CD56lo CD16lo的NK亚群。
2018122003.png


第四步,是T细胞的亚群分析,分析得非常精细,所以在逻辑上可能比髓系的要复杂一些,慢慢看。
CD3+T细胞通过CD4/CD8分为CD4+CD8-的辅助T、CD4+CD8+DPT、CD4-CD8+的细胞毒T、CD4-CD8-的DNT(图上作者把双阴性区域错标成DP了),这里的辅助T和细胞毒T得进行继续分群。
辅助T通过三个方向继续分群,一个方向是通过CD25/CD127分出CD25+CD127-/lo的Treg,一个方向是通过CD38/HLA-DR分出CD38+HLA-DR+的活化辅助T,最后一个方向最复杂,通过CCR7/CD45RA分出CCR7+CD45RA+的Naive T、CCR7-CD45RA+的Effector T、CCR7+CD45RA-的中央记忆T(Tcm)、CCR7-CD45RA-的效应记忆T(Tem),Tcm和Tem继续通过CXCR5/CCR10分为CXCR5+CCR10-的Tfh、CXCR5-的其它Th亚群,CXCR5-的细胞群再进一步通过CCR4/CCR6分为CCR4-CCR6+的Th9、CCR4+CCR6+的Th22/Th17、CCR6-的Th1/Th2/ThGM,Th22/Th17进一步通过CCR10/CXCR3分出CCR10+的Th22和CCR10-的Th17,Th1/Th2/ThGM通过CCR10/CXCR3继续分出CXCR3+CCR10-的Th1、CXCR3-CCR10-的Th2、CXCR3-CCR10+的Th GM-CSF。
细胞毒T同样通过CCR7/CD45RA分出CCR7+CD45RA+的Naive T、CCR7-CD45RA+的Effector T、CCR7-CD45RA-的效应记忆T(Tem),Tcm由于非常少,所以不圈。CD8+Tem可通过CD38/HLA-DR分出HLA-DR+的Tem4,通过CCR6/CCR4进一步分出CCR6-CCR4+Tem1、CCR6+CCR4-Tem2、CCR6-CCR4-Tem3。
2018122004.png


整体看下来,虽然逻辑略显复杂,但还是比较清晰的,一旦做好了模板,后续的分析还是简单的。
只是这个方案未包含B细胞及其亚群,这是一个遗憾。


参考文献:Staser KW, Eades W, Choi J, Karpova D, DiPersio JF. OMIP-042: 21-color flow cytometry to comprehensively immunophenotype major lymphocyte and myeloid subsets in human peripheral blood. Cytometry A. 2018 Feb;93(2):186-189. doi: 10.1002/cyto.a.23303. Epub 2017 Dec 30.


最新评论

吴丽杰 发表于 2019-3-20 09:48:29
倪老师,你好,请问文章附件里面每个抗体滴度的图是怎么做的,还有怎么确定哪个浓度是合适的?谢谢!
niwanmao 发表于 2019-3-20 12:07:23
吴丽杰 发表于 2019-3-20 09:48
倪老师,你好,请问文章附件里面每个抗体滴度的图是怎么做的,还有怎么确定哪个浓度是合适的?谢谢!
...

这个图大多在FlowJo里面合成,图的合成是次要的,主要是确定信噪比哪个浓度最好,就是最佳用量。
吴丽杰 发表于 2019-3-21 16:06:05
谢谢倪老师,我在OMIP-006的附件中看到有一句话是这样说的“each reagent was titered and optimal concentrations were determined based on the following selection criteria: frequency (proper classification of target population), highest staining index (SI, positive median divided by negative standard deviation), highest signal-to-noise  (S:N, positive median divided by negative median), and lowest noise (negative median and CV)“。而在Supp Fig S1a.中看到作者选择的最终使用浓度大多不是按这个标准来的,所以说对pannel中所有抗体滴定时,还是要按实际情况定最终使用浓度。
niwanmao 发表于 2019-3-22 08:39:17
吴丽杰 发表于 2019-3-21 16:06
谢谢倪老师,我在OMIP-006的附件中看到有一句话是这样说的“each reagent was titered and optimal concent ...

你看到的是哪个抗体对不上?我对了几个都是对的上的呀,采用的都是最优滴定量
吴丽杰 发表于 2019-3-22 08:57:01
按照最大SI,最大S:N,最小NegMed这个标准的话,比如CD4-Percp-Cy5.5,0.32ug/ml的SI, S:N都比0.04ug/ml大,而NegMed却小,为什么不选0.32ug/ml, 而选择0.04 ug/ml
niwanmao 发表于 2019-3-22 09:31:52
吴丽杰 发表于 2019-3-22 08:57
按照最大SI,最大S:N,最小NegMed这个标准的话,比如CD4-Percp-Cy5.5,0.32ug/ml的SI, S:N都比0.04ug/ml大 ...

能否截个图看看,我怎么在这篇文章的Supplement里面愣是找不到你说这个荧光素CD4,只看到CD4 BV510
吴丽杰 发表于 2019-3-22 10:26:28
niwanmao 发表于 2019-3-22 09:31
能否截个图看看,我怎么在这篇文章的Supplement里面愣是找不到你说这个荧光素CD4,只看到CD4 BV510 ...

倪老师,您看看是上面的图片

Supp Fig S1a..gif
niwanmao 发表于 2019-3-22 12:22:25
吴丽杰 发表于 2019-3-22 10:26
倪老师,您看看是上面的图片

这张图片是不是另一请Protocol的?跟上面方案的配色不一样
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