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手把手教你用多色流式测小鼠T细胞亚群线粒体和溶酶体

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-1-23 11:03| 查看数: 578| 评论数: 12|帖子模式

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表面标记后进行细胞培养功能检测,很多FLOWER都会有一些困惑,怎么我的细胞分群不清了呢?
这其实是有诀窍的,通过今天这个多色流式检测T细胞各功能亚群的线粒体和溶酶体实验,了解染色的要点和分析方法,不失为一个极好的进阶途径。

1、淋巴细胞悬液制备
1.1 通过批准的方法使小鼠安乐死,例如在透明的丙烯酸柜中吸入CO2,然后颈椎脱位以确保死亡。 注意:保持室内每分钟20%排量的CO2流速,不高于5磅/平方英寸(磅/平方英寸)。 小鼠失去意识需要2-3分钟。 在动物停止呼吸后(总共5-7分钟),保持CO2流量至少1分钟。
1.2 将小鼠背面放在干净的板(例如聚苯乙烯塑料板)上,并用胶带固定四肢。 用70%乙醇冲洗。
1.3 为了取出脾脏,用11厘米的解剖剪刀(脾脏位于胃下方和左肾上方)切开腹腔。 用镊子取出脾脏并清除结缔组织。
1.4 为了取出胸腺,用解剖剪刀从两侧切开横膈膜和肋骨。 用镊子抬起胸骨,露出整个胸腔。 用剪刀小心地将胸腺与周围组织分开,并去除任何残留结缔组织。
1.5 用5mL冰冷的FACS缓冲液(即含2%胎牛血清和1mM EDTA的PBS),在6cm培养皿中机械解离组织(此处推荐流式中文网原研的魔杵®和魔滤®,又快又好,详见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7120-1-1.html,购买链接:https://kdt.im/PhQvsr)。 将单细胞悬液转移至15 mL离心管中; 用另外的2mL FACS缓冲液洗涤培养皿,并将洗涤液与细胞悬浮液合并。
1.6 离心细胞悬液(300×g,4℃ 5分钟),并弃去上清液。 在室温(RT)下用2mL氯化铵裂解液重悬沉淀1分钟以裂解红细胞,接着向细胞悬液中加入10mL FACS缓冲液,以中和氯化铵裂解液。
1.7 离心细胞悬浮液(300×g,4℃5分钟),并弃去上清液。 将细胞重悬于5 mL完全RPMI培养基(RPMI 1640培养基,补充44 mM NaHCO3、10mM HEPES、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1%MEM非必需氨基酸和10%FBS)。
1.8 通过细胞过滤器(孔径70μm)过滤细胞悬液以去除细胞团块。 用血细胞计数器或自动细胞计数器计数细胞。

2、线粒体和溶酶体的定量
注意:之所以先用细胞器特异性染料染色,是因为这些染料的最佳染色条件是37°C温育。而在该温度下,表面抗体容易出现内化,会显著降低表面标志染色强度,所以先染线粒体和溶酶体。

2.1 将1×10E6个细胞加入圆底FACS管中,离心细胞(300×g,4℃ 5分钟)并弃去上清液。
2.2 用预热的37°C无血清培养基中将探针储存液稀释至最终工作浓度(分别为100 nM MitoTracker Green或LysoTracker Green,前者为线粒体特异性染料,后者为溶酶体特异性染料)。

注意:跟抗体一样,这些细胞器的染料也需要测试多种浓度,包括制造商建议的工作浓度范围(线粒体特异性染料为20 - 200 nM,此处使用的溶酶体特异性染料为50 - 75 nM),以获得最佳染色效率。 选择已知靶标染色良好的细胞群作为阳性对照(例如以人CD14 +单核细胞作为溶酶体阳性对照)。 根据阴性群和阳性群染色之间分群良好并且细胞活力保持良好确定工作浓度。

2.3 将细胞重悬于100μL溶酶体或线粒体特异性染料工作溶液中,并分别在5%CO2培养箱中于37°C孵育15分钟或30分钟。
2.4 加入1 mL冰冷的FACS缓冲液以终止反应。 通过离心(300×g,4℃ 5分钟)沉淀细胞并弃去上清液。 接下来就准备进行表面标记染色。

3、淋巴细胞表面标记染色
3.1 用100μL预滴定的2.4G2杂交瘤上清液在冰上封闭Fc受体10分钟。 用1mL FACS缓冲液洗涤细胞并离心(300×g,4℃ 5分钟),去除上清液。
3.2 将细胞与50μL预滴定荧光素抗体组合在冰上FACS缓冲液中孵育20分钟。 避光。
抗体组合如下(除MitoTracker/LysoTracker和PI以外):
2019012301.png

注意:这里要注意设置单染补偿对照和FMO对照,主要是针对线粒体和溶酶体探针所在的通道。

3.3 加入1mL FACS缓冲液洗涤细胞,离心沉淀(300×g,4℃,5分钟)。 弃上清液。
3.4 将细胞重悬于含有1μg/ mL碘化丙啶(PI)的300μLFACS缓冲液中,并立即在流式细胞仪上分析样品。获取的细胞量要足够。

4、分析
胸腺细胞分群,首先排除粘连体(第1、2小图)、排除碎片(第3小图)、排除死细胞(第4小图),接着用CD4/CD8将胸腺细胞分成CD4 SP、CD8SP、DP、DN四个亚群,DN亚群继续通过CD44和CD25分成DN1、DN2、DN3、DN4:
2019012302.png

脾脏细胞的T细胞分群,也是首先排除粘连体(第1、2小图)、排除碎片(第3小图)、排除死细胞(第4小图),接着就是用TCR b圈出T细胞,再用CD4/CD8分出CD4+T和CD8+T,这两个亚群依次用CD44/CD62L分出初始、记忆、效应三个功能亚群:
2019012303.png

胸腺和脾脏各淋巴亚群对应的线粒体定量:
2019012304.png

胸腺和脾脏各淋巴亚群对应的溶酶体定量:
2019012305.png

怎么样,这样的步骤看下来,是否已经很清楚了?当然,实验中可能每个人都会碰到一些细节性问题,但是可以慢慢摸索和完善。有了这个详细的步骤,相信大家可以少走很多弯路。

文献源:Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

最新评论

Veblen 发表于 2019-1-23 21:45:50
MitoTracker/LysoTracker可以直接进入活细胞吗
niwanmao 发表于 2019-1-24 08:15:30
Veblen 发表于 2019-1-23 21:45
MitoTracker/LysoTracker可以直接进入活细胞吗

是的,这两种小分子染料是直接能穿透膜的。
dingshumin 发表于 2019-2-12 14:23:50
请问如检测药物作用前后细胞系线粒体数量变化,流式去除死细胞和碎片后,百分比达到多少说明染色比较充分了呢?另外平均荧光强度可以代表线粒体数量吗?谢谢您
niwanmao 发表于 2019-2-12 23:36:03
dingshumin 发表于 2019-2-12 14:23
请问如检测药物作用前后细胞系线粒体数量变化,流式去除死细胞和碎片后,百分比达到多少说明染色比较充分了 ...


参考顶楼protocol即可保证染色充分,用mfi分析结果
dingshumin 发表于 2019-2-18 13:07:41
niwanmao 发表于 2019-2-12 23:36
参考顶楼protocol即可保证染色充分,用mfi分析结果

谢谢楼主
dingshumin 发表于 2019-3-1 17:14:33
本帖最后由 dingshumin 于 2019-3-1 17:19 编辑

楼主您好,这是我先染线粒体后染凋亡的图,凋亡用的FITC和PI,线粒体是6通道,然后怎么活细胞多线粒体标记的也多,死细胞多线粒体染色比例低呢?
微信图片3.jpg
微信图片4.jpg
niwanmao 发表于 2019-3-2 15:20:44
dingshumin 发表于 2019-3-1 17:14
楼主您好,这是我先染线粒体后染凋亡的图,凋亡用的FITC和PI,线粒体是6通道,然后怎么活细胞多线粒体标记的 ...

这应该是正常才对啊
dingshumin 发表于 2019-3-2 23:37:13
niwanmao 发表于 2019-3-2 15:20
这应该是正常才对啊

用了药的死得多,我是想分析用了药还活着的细胞线粒体数量是怎样的,是不是线粒体分裂增加了,应该怎么看呢楼主
niwanmao 发表于 2019-3-2 23:43:20
dingshumin 发表于 2019-3-2 23:37
用了药的死得多,我是想分析用了药还活着的细胞线粒体数量是怎样的,是不是线粒体分裂增加了,应该怎么看 ...

那么你的设门顺序应该是圈AV-PI-细胞的FL6表达强度
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