凋亡划门调整

chinals90

论坛的各位老师，你们好！很感谢你们之前的解答，在此论坛获益良多，谢谢坛主提供这么好的平台！
我最近在做凋亡，用的是癌症细胞系，染料是annexin v pe和7-aad，流式机器是bd的，根据空白组圈除细胞碎片和团块，用促进凋亡试剂剂量最高组的细胞分别单染划定十字象限，阴性<1%,根据十字坐标分析给药剂量时发现坐标正好在细胞团正中间，高低剂量组的也无任何差别，请问老师我的划门及其十字坐标确定有无问题？我怀疑纵坐标是否太靠左···

bear_honey

chinals90 发表于 2019-3-26 20:15
空白双染怎么提供参考呢？有没有办法办法降低背景

正常细胞不做任何促进凋亡的处理，进行Av和7aad的染色，这样不凋亡的细胞的Av信号是什么样的就有一个参考了呀，这个肯定比空白不染色的细胞有参考价值，最后还是要看实际样品的分群来进行圈门。。。流式的圈门很多时候是根据分群来的，尤其是阴性阳性区分不明显的时候，很难讲有一个统一的标准。。。所以多做一些对照会更有帮助，比如前面提到的不处理的细胞，还有逐渐递增一些药物处理的浓度，看AV信号的递增情况之类的

bear_honey

7-AAD我觉着画低了，可以再高一点，我每次都是根据样品具体的情况来画门的；annexin v我感觉会有一些背景的荧光，即使是没有凋亡的细胞，所以最好有一组是未经任何处理的细胞染7AAD和ANNEXIN V来给自己一个正常细胞两个通道信号的参考。。。

niwanmao

不能根据空白对照，因为AV和PI染上之后，会有非特异性增强，需根据分群来设门。

chinals90

bear_honey 发表于 2019-3-26 10:50
7-AAD我觉着画低了，可以再高一点，我每次都是根据样品具体的情况来画门的；annexin v我感觉会有一些背景的 ...

空白双染怎么提供参考呢？有没有办法办法降低背景

chinals90

niwanmao 发表于 2019-3-26 19:46
不能根据空白对照，因为AV和PI染上之后，会有非特异性增强，需根据分群来设门。

...

根据分群划门，每个人的判断都有一定的偏差，那如何尽量标准呢?

niwanmao

chinals90 发表于 2019-3-26 20:17
根据分群划门，每个人的判断都有一定的偏差，那如何尽量标准呢?

不会。
凋亡的分群一向都是很清楚的。如果分群不清，说明是试剂不够好。遇到分群不清的时候，只能用正常几乎无凋亡样本＋阳性凋亡样本结合起来，把十字门位置确定下来。

tiger

chinals90 发表于 2019-3-26 20:15
空白双染怎么提供参考呢？有没有办法办法降低背景

用Annexin V分析调亡，不论是FITC、PE或APC标记的，不同于细胞表型CD系列，其背景很高，不能简单的用空白管来确定阳性门。只能根据样品的阴阳细胞的明显界限来圈门。所以同一批样品，不同的药物浓度，固定一个门有时也是不合适的。