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外泌体提取的7种方法及其优缺点

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-3-27 15:21| 查看数: 842| 评论数: 1|帖子模式

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流式中文网注:外泌体的文章近十年的增长速度较快,新出的流式细胞仪也开始把最低检测限瞄准外泌体这个层级,所以有必要了解一下外泌体的提取,为检测打下基础。

作者:Konstantin Yakimchuk
DOI:https://dx.doi.org/10.13070/mm.en.5.1450
Datelast modified : 2019-03-06;
original version : 2015-08-15
MATER METHODS 2015;5:1450
1、差速离心
差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。 该方法包括几个步骤,包括1)低速离心去除细胞和凋亡碎片,2)更高速离心以消除更大的囊泡,最后,3)高速离心沉淀外泌体。

                               
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不过需要注意的是,样本的粘度与分离的外泌体纯度有显著的相关性,因此,具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。
步骤:
以300×g离心10分钟,取上清。
以2000×g离心10分钟,取上清。
10,000×g离心30分钟,取上清。
100,000×g,在4℃下持续离心90分钟,去掉上清,留下的沉淀PBS重悬后,再次以100,000×g离心90分钟。

2、密度梯度离心
该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合,实现外泌体与非囊泡颗粒分离,例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。 因此,该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开,能够提取含量低的外泌体。
但是,合适的离心时间非常重要,否则如果它们具有相似的密度,则仍可在外泌体中发现污染颗粒。
2018年Li K等人改良了此方案,回收率更高、纯度更高,并且结构和功能保持更好(Li K, Wong D, Hong K, Raffai R. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC): A Refined and High Performance Method for the Isolation, Characterization, and Use of Exosomes. Methods Mol Biol. 2018;1740:69-83

3、尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(Size-exclusion chromatography,SEC)是基于大小而非分子量实现分离大分子。 该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子,分子根据其直径通过微球,半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移,而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。 尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。 此外,可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。 与离心方法相比,色谱分离已被证明具有更多优势,因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响,这可能会改变囊泡的结构。 目前,SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。
不过,该方法耗时较长,不适合大量样本处理。

4、过滤
超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小,从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。
最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径,可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体,也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体:

                               
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不过,该方法由于过滤膜的粘附,可能会损失外泌体,并且过滤时的压力和剪切力,可能会使外泌体变形受损。

5、基于聚合物的沉淀技术
基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合,在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇(PEG)。用这种聚合物沉淀具有许多优点,包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。
然而基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物(包括脂蛋白)而且,聚合物材料的混杂可能会影响下游分析。

6、免疫分离技术
免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球,特异性结合外泌体。
例如使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌体。
然而,使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。
还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面,直接分离后检测、分析、定量。最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子(ISPN)来结合外泌体,研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN,并用它们从体液中分离外泌体。

7、通过筛分分离
该技术利用压力或电场,通过膜从样本中筛出外泌体:

                               
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该方法分离时间短,可以提供较高纯度的外泌体。
但是回收率低。
有这么多方法,大家可以根据自己的样本,选择合适的方法去分离吧,详细的方法步骤,可参考《Exosomes: Isolation and Characterization Methods and Specific Markers》中的相关文献。


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