查看: 994|回复: 16
收起左侧

[细胞增殖] CFSE脾脏淋巴细胞增殖图,向大家请教

[复制链接]
发表于 2019-5-7 21:57:24 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 甜鼠肉乎乎 于 2019-5-30 09:10 编辑

我做的是脾脏淋巴细胞增殖实验,所用实验条件如下
小鼠脾脏细胞经过T细胞阴选试剂盒分选后,CFSE染色(两个浓度1.25和2.5微摩),细胞浓度设定两种,2×105和4×105接种至96孔U型板(提前包被CD3/28,浓度均为5微克/毫升),然后加入实验所需要验证的抗原肽(浓度梯度为5,10,20微克/毫升),培养五天(第四天培养基变黄换新,所以第四天没有跑流式)。
画门方法如下,
TIM截图20190507205403.jpg
整合后如下图

CFSE1.25 微摩 细胞密度为2×105

CFSE1.25 微摩 细胞密度为2×105

CFSE1.25 微摩 细胞密度为4×105

CFSE1.25 微摩  细胞密度为4×105

TIM截图20190507210318.jpg

CFSE2.5 微摩 细胞密度2×105

CFSE2.5 微摩 细胞密度2×105

CFSE2.5 微摩 细胞密度4×105

CFSE2.5 微摩 细胞密度4×105

TIM截图20190507214159.jpg


这个实验已经做了很久了,因为实验室没人做,自己摸索的觉得很难,目前得到的一些问题就是
1好像细胞浓度2比4好一些,但是先前看论坛里是细胞密度高一些更好。
2 原来没有加过CD3/28做过一次,因为想着比较抗原肽的增殖效果,加入其它的刺激就不合适了,但是做出来的趋势不好,这次就加了CD3/28。相对比感觉好像同时加入抗原肽的比单纯的CD3/28的增殖好那么一丢丢。不知道是不是我的错觉啊
3 做不出来文献中那种贴合很紧密的连续峰,不知道是哪里出了问题,难道是细胞不够纯吗,需要用CD4阳性的细胞分选后做吗?
4 不同的CFSE浓度得出的最好的增殖结果的实验条件好像不一样。CFSE1.25时,感觉细胞密度低一些,然后肽的浓度是5,培养5天的时候比较好。
CFSE2.5的时候,感觉细胞密度高一些的,然后肽的浓度是20,培养3天的时候增值效果比较好。不知道接下来用哪种条件做合适?
5 如果有其他BUG的话,我没有挑出来,非常希望大家能帮我指出来。

多谢多谢

CFSE和FVD

CFSE和FVD

发表于 2019-5-8 09:47:38 | 显示全部楼层
子代的细胞怎么这么少?
 楼主| 发表于 2019-5-11 22:13:39 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-5-8 09:47
子代的细胞怎么这么少?

非常感谢倪老师的回复,我用的培养基是IMDM+10%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%双抗,这个培养基配方您看有问题吗?
另外我的CD3/28包板子后没有吸出来,是不是细胞一部分刺激死了?因为好像只有倒数第二排图的子代细胞多一点,是不是也是不够?
发表于 2019-5-12 19:53:39 | 显示全部楼层
甜鼠肉乎乎 发表于 2019-5-11 22:13
非常感谢倪老师的回复,我用的培养基是IMDM+10%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%双抗,这个培养基配方您 ...

不知道CFSE和FVD双参数图如何的分布?
 楼主| 发表于 2019-5-16 22:32:46 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-5-12 19:53
不知道CFSE和FVD双参数图如何的分布?

不好意思倪老师,我的FVD和CFSE的图上传在帖子的原文中了,麻烦您帮我看一下。P2门是去粘连细胞,然后画的FVD和CFSE。
另外有个问题想请教您和各位前辈,就是我如果想检验这个抗原肽对混合淋巴细胞的增殖能力的影响,同时加入CD3/28并做了同行对照可以吗?
另外我如果想检验这个抗原肽对TH17细胞的增殖能力影响,不知道应该选择哪个方式,有三个拟实行的方案:
1:一只健康小鼠脾脏混合淋巴细胞分选出CD4+T细胞后,CFSE孵育,分为对照组,CD3/28组,CD3/28+抗原肽组,培养三天后流式检测IL-17。
2:一只健康小鼠,一只造模小鼠,分别取脾脏混合淋巴细胞分选出CD4+T细胞,CFSE孵育,各加入抗原肽,培养三天后流式检测IL-17。
发表于 2019-5-19 15:00:24 | 显示全部楼层
首先没懂楼主的图例到底是什么意思?楼主帖子中说CFSE浓度用了两个分别是2.5uM和5uM,图例上发现CFSE的浓度又变成了1.25uM和2.5uM,到底用的哪个浓度,因为我最近也做类似的实验,我发现终浓度为5uM的CFSE孵育细胞后,离完心,细胞沉淀特别的黄,不知道楼主有没有类似的体会,我在想CFSE浓度高也会对细胞有损伤作用。
再次,楼主在刺激第二天的时候有没有镜下观察过,细胞是否成簇成团明显,是否有大的淋巴母细胞存在,激活起来的淋巴细胞,由于聚集,与未刺激组相比,会导致孔中出现大量的留白,而未刺激的淋巴细胞在孔中分布比较均匀。
另外,楼主选用的FVD是什么光,是否与CFSE调过补偿了?我的经验是CFSE的补偿在某些通道非常高,CFSE比FITC的强度强的不是一星半点。
最后,如果淋巴细胞刺激起来了,楼主FSC-SSC圈门可能圈的有问题,刺激起来的淋巴细胞前侧向门上就不是原来的那一群了,而是靠后的一群。
我也是处于摸索中,与楼主讨论一下吧
 楼主| 发表于 2019-5-30 09:22:54 | 显示全部楼层
immunology 发表于 2019-5-19 15:00
首先没懂楼主的图例到底是什么意思?楼主帖子中说CFSE浓度用了两个分别是2.5uM和5uM,图例上发现CFSE的浓度 ...

帖子已经进行修改,浓度是1.25和2.5,非常抱歉自己的不严谨造成大家的困扰
镜下观察就是在第3天的时候会有成团聚集前两天的不明显
FVD通道是KO525
请问你做的时候也是用健康小鼠的混合淋巴细胞刺激吗?
发表于 2019-7-17 10:18:20 | 显示全部楼层
immunology 发表于 2019-5-19 15:00
首先没懂楼主的图例到底是什么意思?楼主帖子中说CFSE浓度用了两个分别是2.5uM和5uM,图例上发现CFSE的浓度 ...

请问最近还在做CFSE吗?我一直在被这实验困扰,有时间可以一起讨论下吗?
发表于 2019-7-18 13:54:50 | 显示全部楼层
之前做过一些人的T细胞增殖实验,效果不错,能看到明显的多次的增殖峰,可能会和小鼠有一些不同,但是可以给你一定的参考:
1,cFSE浓度过高会有毒性使细胞死亡,之前用的是2uM的浓度
2,CD3 CD28的浓度也需要你重新摸索,我们之前用coat 1ug/mL CD3和加2ug/mL 的CD28的激活效果已经很好了,coat 0.3ug/mL的CD3也能激活,相对要弱一些,感觉浓度太高,细胞也可能过度激活而导致死亡。
3,激活的细胞会明显的增大,再说你是阴选出来的纯化T 细胞,为什么不把所有的FSC/SSC都圈门了呢?
4,我们是用high binding的96孔板做的实验,因为之前做MLR的时候感觉U底板做的结果不是特别好

评分

参与人数 1流星 +5 收起 理由
niwanmao + 5 感谢分享

查看全部评分

 楼主| 发表于 2019-7-20 15:21:04 | 显示全部楼层
qscdawx 发表于 2019-7-18 13:54
之前做过一些人的T细胞增殖实验,效果不错,能看到明显的多次的增殖峰,可能会和小鼠有一些不同,但是可以 ...

多谢您的建议,我准备再试试看
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则

流式中文网    

联系我们: mail#flowcyto.cn (#改为@)

GMT+8, 2019-10-18 12:26

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.